《天然植物人參中糖醛酸含量測定方法的建立》論文發表期刊：《今日畜牧獸醫》；發表周期：2021年01期

《天然植物人參中糖醛酸含量測定方法的建立》論文作者信息：朱明月，女，本科，研究方向：可飼用天然植物飼料添 加劑的研發

　　摘要：目的建立天然植物人參中糖醛酸的含量測定方法。方法以間羥聯苯法測定人參飲片中糖醛酸的含量，并對該方法的測定條件及供試品溶液制備方法進行優選，對方法學進行考察。結果供試液在3h內顯色穩定，重現性好，平均回收率為100.49%，RSD為2.63%。糖醛酸含量為3.99%，RSD為1.23%。結論該方法簡便、快速、準確。可為人參飲片中糖醛酸的質量控制提供參考。

　　關鍵詞：人參;糖醛酸;問羥基聯苯法

　　作為“東北三寶”之一的人參，在中國藥用歷史悠久。人參中含有多種有效成分，但對人參的研究，多集中于人參皂苷。近年來，關于人參多糖的報道越來越多，現代研究發現，人參多糖具有增強機體免疫力1和通過提高免疫力輔助抗腫瘤的作用10，顯示多糖對人參藥用價值的發揮亦起著重要作用。研究表明，人參多糖中的酸性多糖，即含有糖醛酸結構單元的多糖生物活性較高"0。目前，藥典“人參"飲片項下只有人參皂苷含量的測定方法，但未見人參中糖醛酸含量測定方法研究的報道。因此，本試驗擬建立一種準確可靠的人參中糖醛酸含量測定方法，為人參飲片中人參多糖的質量控制提供可借鑒的分析方法。

　　1儀器與材料

　　1.1儀器

　　UV2550型紫外-可見分光光度計(日本島津)

　　AUW120D型電子天平(日本SHIMADZU公司)

　　1.2藥物與試劑

　　D-半乳糖醛酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：

　　111646-200301，供含量測定用)，四硼酸鈉(美國Sigma公司)，間羥聯苯(美國Sigma公司)，咔唑(北京化學試劑公司)，其他試劑均為分析純。

　　1.3藥材

　　人參藥材購于安國藥材市場，經本公司質控部鑒別符合

　　《中華人民共和國藥典》2015版(1部)有關項下規定122方法與結果

　　2.1供試品溶液的制備

　　取人參細粉0.25g，置圓底燒瓶中，加80%乙醇150ml，加熱回流1h，趁熱濾過，殘渣用80%熱乙醇洗滌3次，每次10ml，洗滌液棄去。將殘渣及濾紙置燒瓶中，加水100ml，加熱回流1h，濾過。殘渣再加水100ml，加熱回流1h，趁熱濾過。殘渣及燒瓶用熱水洗滌4次，每次10ml，合并濾液及洗滌液，放冷，轉移至250ml.量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾紙過濾，取續濾液，即可。

　　2.2對照品溶液的制備

　　稱取D-半乳糖醛酸對照品10.08mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

　　2.3顯色劑的配制

　　2.3.1四硼酸鈉-硫酸溶液的制備

　　稱取四硼酸鈉4.78g，置1000ml，量瓶中，加硫酸超聲(功率250W，頻率40kH2)使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得(0.0125

　　mol/L.四硼酸鈉-硫酸溶液)。

　　2.3.2間羥聯苯溶液的制備

　　稱取間羥聯苯0.15g，置100mL.量瓶中，加0.5%的氫氧化鈉溶液超聲(功率250W，頻率40kH2)使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得(0.15%間羥聯苯溶液)。

　　2.4顯色條件考察

　　2.4.1最大吸收波長的選擇

　　精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6mL，置具塞試管中，于冰水浴中分別加入0.4mL.純化水，搖勻，于冰水浴中，加入D-半乳糖醛酸對照品溶液0.6ml，搖勻，置沸水浴中加熱12min，取出，置冰水浴中放冷至室溫，加人間羥聯苯溶液80uL，搖勻，室溫放置40 min，以1mlL.純化水同上操作制得空白溶液調零，以紫外可見分光光度計，在400-700 nm進行光譜掃描，結果顯示，525mm波長處吸光度值最大，因此，確定檢測波長為525mm。

　　2.4.2四硼酸鈉-硫酸溶液用量考察精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液3ml、4mlL，5ml.、6mL、7mL

　　8mL，分別置具塞試管中，于冰水浴中分別加入0.4mL.純化水，搖勻，各加入D-半乳糖醛酸對照品溶液0.6ml，搖勻，其余操作同

　　2.4.1項，測定吸光度。結果顯示：隨著四硼酸鈉-硫酸溶液用量的增加，D-半乳糖醛酸對照品溶液吸光度值先升高然后降低，其中以四硼酸鈉-硫酸溶液用量為6ml.的吸光度值最大。因此，確定四硼酸鈉-硫酸溶液最佳用量為6ml

　　2.4.3沸水浴時間考察

　　精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6mL，平行七份，分別置具塞試管中，于冰水浴中分別加入0.4mL.純化水，搖勻，各加入D-半乳糖醛酸對照品溶液0.6ml，搖勻，置沸水浴中分別加熱4min、6min、8min、10min，12min、14min，16min，其余操作同2.4.1項，測定吸光度。結果顯示：沸水浴時間不同時，對照品溶液吸光度基本沒有差異，說明沸水浴時間為4min時，已反應完全。

　　2.4.4間羥聯苯用量考察

　　精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6mL，平行十份，分別置具塞試管中，于冰水浴中分別加入0.4ml.純化水，播勻，各加入D-半乳糖醛酸對照品溶液0.6ml，搖勻，置沸水浴中加熱4min，取出，置冰水浴中放冷至室溫，再分別加入間羥聯苯溶液30uL.40ul.

　　50 L.，60L70uL.80ul90uL 100uL，，其余操作同2.4.11項，測定吸光度。結果顯示：隨著間羥聯苯用量的增加，對照品溶液吸光度值先增大后減小，其中以間羥聯苯用量為80uL的吸光度值最大，因此，確定間羥聯舉最佳用量為804L

　　2.4.5顯色時間(室溫放置時間)考察

　　精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6ml，置具塞試管中，于冰水浴中加入0.5mL.純化水，搖勻，加入D-半乳糖醛酸對照品溶液

　　0.5mlL，搖勻，置濡水浴中加熱4min，取出，置冰水浴中放冷至室溫，加入間羥聯苯溶液80uL，搖勻，同法制備相應空白溶液，以紫外可見分光光度計，每隔5min測定一次525mm波長處的吸光度，連續測定60min，結果顯示：顯色時間不同時，對照品溶液吸光度的RSD值為0.30%，吸光度基本沒有差異，說明顯色5min即可。

　　2.5供試品溶液制備方法考察

　　2.5.1供試品溶液制備方法比較

　　為了考察人參皂苷對糖醛酸含量測定是否存在干擾，對80%乙醇醇提皂昔后再水提糖醛酸和直接水提糖醛酸的方法進行比較，光譜掃描圖見圖1。

　　顯色后顏色比較：醇提皂昔后再水提糖醛酸，供試品溶液顯色后為磚紅色;直接水提糖醛酸，供試品溶液顏色為咖啡色，兩種供試品溶液制備方法顯色后顏色不一致。最大吸收波長比較：醇提皂背后再水提糖醛酸，最大吸收波長為525mm，與對照品最大吸收波長一致，直接水提糖醒酸，最大吸收波長為508nm，與對照品最大吸收波長525mm不一致。綜上所述，若直接水提進行顯色，則藥材中人參皂苷對糖醛酸含量測定存在干擾。因此，需醇提皂昔排除干擾后再水提糖醛酸進行檢測，

　　2.5.2醇提次數比較

　　對80%乙醇醇提皂昔的次數(1次、2次、3次)進行了比較，結果顯示：醇提次數不同時，供試品溶液顯色后顏色一致，均為磚紅色，且最大吸收波長均在525nm附近，且糖醛酸含量差異較小，說明提取1次，人參皂昔已提取完全，因此確定80%乙醇醇提次數為1次。

　　2.5.3溶劑用量考察

　　對糖醛酸提取溶劑(水)用量-50mlL、100mL、150mL.

　　200ml進行了考察，結果顯示：隨著溶劑用量的增加，糖醛酸含量增高，但溶劑用量為100mL，、150mL和200mL時，糖醛酸含量差異較小，因此，確定溶劑用量為100mL。

　　2.5.4水提次數考察

　　對糖醛酸水提次數進行了考察，結果顯示：隨著水提次數的增加，糖醛酸含量增高，但水提2次和3次，糖醛酸含量差異較小，說明提取2次，糖醛酸已提取完完全。因此，確定水提次數為2次。

　　2.6標準曲線的制備

　　精密量取四硼酸鈉-硫酸溶液6ml，置具塞試管中，平行六份，于冰水浴中分別加入D-半乳糖醛酸對照品溶液0.1mL.

　　0.2mlL.0.3mL 0.4mL.0.5ml、0.6mL，以純化水補足1.0ml，搖勻，置沸水浴中加熱4min，取出，置冰水浴中放冷至室溫，再分別加人間羥聯苯溶液80uL，搖勻，室溫放置5min，同法制備空白溶液，以紫外可見分光光度計，分別測定525nm處的吸光度，并制備標準曲線，結果見圖2

　　上述結果顯示：以D-半乳糖醛酸濃度為橫坐標()，吸光度為縱坐標(y)作標準曲線，方程為y=0.0132x-0.0168(=0.9997)，說明D-半乳糖醛酸溶液對照品溶液在10.08ug/mL-60.484g/

　　ml范圍內線性關系良好。

　　2.7方法學考察

　　2.7.1重復性考察

　　按取樣量0.8：1.01.2的比例分別稱取樣品，各平行三份，精密稱定，按已確定的方法制備供試品溶液，并吸光度，計算糖醛酸含量。九份樣品測定結果RSD值為2.26%，該方法重復性良好。

　　取對照品溶液及重復性考察項下的供試品溶液，以間羥聯苯法顯色，對對照品溶液和供試品溶液連續測定6次525mm處吸光度，計算RSD值。對照品和供試品溶液RSD值分別為

　　0.08%和0.00%，該方法精密度良好。

　　2.7.3穩定性考察

　　取對照品溶液及重復性考察項下的供試品溶液，以間羥聯苯法顯色，每隔30min測定一次525mm處的吸光度，連續測定3h，計算RSD值。對照品和供試品溶液RSD值分別為0.77%和

　　2.15%，表明供試品溶液在3h內顯色穩定。

　　2.7.4回收率考察

　　按取樣量0.25g的1/2即0.125g稱取本品，精密稱定，平行9份，取已知濃度的的D-半乳糖醛酸對照品溶液，按照0.8：1.0：

　　1.2的比例分別加入樣品溶液中，各平行三份，按確定的樣品處理方法制備供試品溶液，以間羥聯苯法測定糖醛酸含量，計算回收率及回收率的RSD值。結果見表1上述結果顯示：九份供試品溶液中，D-半乳糖醛酸回收率介于95%105%之間，回收率均值為100.49%，RSD值為2.63%，該方法回收率良好。

　　2.8人參多糖中糖醛酸的含量測定

　　精密稱取人參細粉0.25 g，按照"2.1"項下供試品溶液制備方法和"2.4"項下顯色條件顯色，測定吸光度，計算供試品溶液中糖醛酸含量。結果人參中糖醛酸含量為3.99%，RSD為1.23%(n=3)。

　　3討論

　　文獻顯示，糖醛酸含量測定方法分為“咔唑法”和間羥聯苯法"兩種，味唑法收載于《國家中成藥匯編》中"人參多糖注射液項下;間羥聯苯法見于文獻，該文獻報道咔唑法在測定人參酸性多糖中糖醛酸含量時，因中性糖與硫酸咔唑絡合形成棕色衍生物，從而對糖醛酸含量測定存在干擾。筆者對啡唑法和間羥聯苯法進行了比較，試驗結果顯示：采用間羥聯苯法測定時，對照品溶液和供試品溶液最大吸收波長均為525nm，且供試品溶液和對照品溶液均為紫紅色;采用咔唑法測定時，對照品溶液最大吸收波長在525mm，而供試品溶液最大吸收波長在539mm，兩者最大吸收波長不一致，對照品溶液為紫紅色，而供試品溶液為咖啡色;且咔唑法和間羥聯苯法相比，供試品溶液的吸光度咔唑法比間羥聯苯法高0.286，說明咔唑法測定糖醛酸含量時，確實對測定結果的影響，同時驗證間羥聯苯法的可行性。因此，確定人參伙片中糖醛酸含量測定方法為間羥聯苯法。

　　供試品溶液制備方法考察過程中，考慮到人參中含有皂苷和多糖兩類成分，因此，筆者對皂昔是否對糖醛酸含量測定存在干擾進行了考察，結果發現，皂昔類成分存在時，間羥聯苯法顯色后，供試品溶液的顏色和最大吸收波長均存在差異，說明皂昔類成分的存在，對糖醛酸含量測定確實存在干擾。因此，供試品溶液制備方法中確定先醇提除去人參皂昔，然后再水提多糖，以保證含量測定方法的準確度。

　　經多次試驗驗證，間羥聯苯法測定人參飲片中糖醛酸含量，重復性好，準確度高，適用于人參飲片中糖醛酸含量的測定。該方法可為藥典“人參”飲片項下人參酸性多糖質量控制提供參考，以便更好地控制人參伙片質量。

　　參考文獻

　　[1]Zhang X，Yu L，Bi H T，et al.Total fractionation and characterization of the water-soluble polysaccharides isolated from Panax ginseng C.A.Meyer[J].Carbohydr Polym，2009，77：544.

　　[2]Lim T，Na K，Choi E，et al.Immunomodulating activities of polysaccharidesisolated from Panax girseng[].J Med Food，

　　2004，7(1)：1.

　　[3]Choi H，Kim K，Sohn E，et al.Red ginseng acidic polysaccharide(RGAP)in combination with IFN-y results in enhanced macrophage function through activation of the NF-B pathway[UJ].Biosci Biotech Bioch，2008，72(7)：1817.

　　[4]Cheng H R，Li S S，Fan Y Y，et al.Comparative studies of the antiproliferative effects of ginseng polysaccharides on HT-29

　　human colon cancer cells[].Med Oncol，201 1(28)：175.[5]Fan Y Y，Cheng H R，Li S S，et al.Relationship of the inhibition of cell migration with the structure of ginseng pectic polysac-charides[1].Carbohyd Polym，2010(81)：340.

　　[6]Ni W H，Zhang X，Bi H T，et al.Preparation of a glucan from the roots of Rubus crataegifolius Bge.and its immunological activity[U].Carbohydr Res，2009，344(18)：2512.

　　[7]Shin H，Kim Y S，Kwak Y，et al.A further study on the inhibition of tumor growth and metastasis by red ginseng acidic polysaccharide(RGAP)[1].Nat Prod Sci，2004，10(6)：284.

　　[8]Shin HJ，Kim Y S，Kwak Y S，et al.Enhancement of antitumor effects of paclitaxel(taxol)in combination with red ginseng acidic polysaccharide(RGAP)[].Planta Med，2004，70(11)：

　　1033.

　　[9 Du X F，Jiang C Z，Wu C F，et al.Synergistic immunostimulating activity of pidotimod and red ginseng acidic polysaccharide against cyclophosphamide-induced immunosuppression[].Arch Phamm Res，2008，31(9)：1153.

　　[10]倪雛華，人參多糖免疫活性及抗腫瘤作用[D].吉林：東北師范大學，2010.

　　[11]俞丹，馬龍，趙軍，等，頭瑣葡萄多糖中糖醛酸含量的測定[].新疆醫科大學學報，2009，32(5)：533.

　　[12]中華人民共和國藥典一部.[5].北京：中國醫藥科技出版社，2015.

　　[13]陳巧巧，萬琴，王振中，等人參多糖中糖醛酸含量測定方法的建立，中國試驗方劑學雜志，2012，18(8)：122.