摘要鄰硝基苯￣β￣D￣吡喃半乳糖苷(ONPG)法和雙糖酶法是常用的乳糖酶活力測定方法，本文對這兩種方法的線性范圍、檢出限、精密度、準確度和穩(wěn)定性進行了比較。結果顯示，ONPG法在線性范圍、檢出限、精密度以及穩(wěn)定性方面均優(yōu)于雙糖酶法，但此種方法的重復性較差，需要進一步的優(yōu)化。對比這兩種方法，可為乳糖酶活力測定方法的合理選取提供參考。

　　關鍵詞：鄰硝基苯￣β￣D￣吡喃半乳糖苷法;雙糖酶法;乳糖酶活力測定;方法學比較

　　乳糖酶是一種與腹瀉相關的重要腸道功能酶，乳糖酶活性測定方法對乳糖酶缺乏癥的診斷及乳糖酶制劑的活性測定非常重要。目前，乳糖酶活性定量檢測方法主要有:雙糖酶法、鄰硝基苯￣β￣D￣吡喃半乳糖苷(ONPG)試驗法、穩(wěn)定同位素法、高效液相色譜法及糞便還原糖測定法[1]。雙糖酶法[2]、ONPG試驗法[3]因其試劑組成簡單、成本低、操作簡便等特點而在實驗室中得到廣泛的應用。ONPG法的原理為ONPG在乳糖酶的作用下生成鄰硝基酚(ONP)，ONP在堿性的條件下呈現(xiàn)黃色，可利用紫外￣可見分光光度法(UV￣Vis)在波長420nm處檢測。

　　雙糖酶法是臨床采取小腸粘膜樣本進行雙糖酶活性測定的檢測方法，亦稱小腸粘膜活檢法，此種方法測乳糖酶活力的原理為乳糖在乳糖酶的作用下分解為等量的葡萄糖和半乳糖，葡萄糖在葡萄糖氧化酶作用下釋放出H2O2，后者在過氧化氫酶作用下使無色的鄰聯(lián)茴香胺氧化顯紅色，可在420nm處利用UV￣Vis檢測。本文對兩種常用乳糖酶測定方法的線性范圍、檢出限、精密度、重復性以及穩(wěn)定性進行比較，旨在為乳糖酶活性測定方法提供一定的參考。

　　通過空白溶液的吸光值(見輔助材料表S1和表S2)和標準曲線計算得ONPG法和雙糖酶法的檢出限(S/N=3)分別為156和170U/g。雙糖酶法在低濃度時成線性關系而高濃度偏離線性的原因可能有以下兩點:首先，雙糖酶法中所用顯色劑主要是由葡萄糖氧化酶、過氧化物酶等組成，大部分酶均存在飽和點，即在一定的條件下，當所有的酶與底物結合生成中間產(chǎn)物后，即使再增加底物濃度，中間產(chǎn)物濃度也不會增加，酶促反應速度也不增加[4]，這可能就是雙糖酶法標準曲線測定中吸光值不會隨葡萄糖含量的增加而無限增加的原因。其次，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下生成葡萄糖酸和過氧化氫，當體系中H2O2的含量增加時，部分過氧化氫被過氧化物酶分解，這可能導致吸光值隨著葡萄糖含量增加反而有所下降。按兩種方法平行配制6份樣品，每份樣品在相同的條件下測定10次，結果見輔助材料表S3與表S4。

　　ONPG法6個平行樣品酶活10次測量的RSD分別為0.32%、0.23%、0.23%、0.16%、0.12%和0.33%，平均RSD為0.23%;而雙糖酶法6個平行樣品酶活10次測量的RSD分別為0.94%、1.13%、1.36%、1.22%、1.08%和0.68%，平均RSD為1.07%。ONPG法6個樣品的10次測量平均值的RSD為7.71%，而雙糖酶法為3.87%。

　　由此可以發(fā)現(xiàn)ONPG法的精密度較好，而重復性較差，可能原因與ONPG底物溶液不穩(wěn)定有關[1]，久置可見許多絮狀物，而ONPG底物溶液一般需放置一周后才能使用，這可能是導致ONPG重復性差的原因。雙糖酶法的重復性較好，但是精密度較差，可能與反應后整個溶液體系的穩(wěn)定性有關。鄰苯二茴香胺在95%乙醇中溶解度并不大，能明顯地看到棕褐色細小的懸浮物存在。這一點從加入曲拉通X￣100中可以得到佐證。

　　曲拉通X￣100為非離子表面活性劑，在UV￣Vis中可用于增加溶液的穩(wěn)定性以及靈敏度[5]。另外葡萄糖被葡萄糖氧化酶氧化生成的葡萄糖酸微溶于乙醇等有機溶劑[6]，而Tris￣glucoseoxidase(TGO)顯色劑中鄰苯二茴香胺、曲拉通X￣100洗滌液均為95%的乙醇溶液配制，這在一定的程度上解釋了雙糖酶法精密度差的原因�？紤]到ONPG法的重復性較差，故在相同的條件下按兩種方法各配制3份樣品，將3份樣品混合放置不同時間，分別測定兩種方法的吸光值。

　　ONPG法所配制的樣品隨著放置時間的延長波動較小，反映用此種方法所得到的反應體系液較為穩(wěn)定。而用雙糖酶法所配制的樣品隨放置時間的延長波動較大，提示用此種方法測定乳糖酶活力時應盡早測定，這樣得到的結果較為可靠。上述研究表明，ONPG法在線性范圍、檢出限、精密度以及穩(wěn)定性方面均優(yōu)于雙糖酶法，是實驗室乳糖酶活力測定的首選方法。但由于ONPG底物溶液的不穩(wěn)定性，導致平行樣品之間吸光值偏差較大，需要進一步進行方法優(yōu)化，例如，可將底物溶液進行離心后再統(tǒng)一進行測定。實驗部分722型紫外￣可見光分光光度計(UV￣Vis，上海創(chuàng)萌生物科技有限公司)。

　　ONP為分析純試劑;ONPG、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶和二茴香胺均為生物試劑，乳糖酶為食品級，以上試劑均為市售;三羥甲基氨基甲烷(Tris，生物試劑美國Amresco公司)，蒸餾水自制。參照文獻[3]，在潔凈的試管中加入1mL5mg/mL樣品酶液，平行制作3份，37℃預熱后加入1mL20mmol/LONPG底物溶液，置于37℃的恒溫水浴鍋中反應10min。隨后加入3mL0.5mol/L的Na2CO3溶液終止反應，于420nm處測定吸光值。

　　空白對照中樣品酶活事先經(jīng)過滅活，其它步驟與上述一致。參照文獻[2]，在潔凈的試管中加入0.1mL5mg/mL樣品酶液，預熱后加入0.1mL0.056mol/L乳糖底物溶液，平行制作3份，于37℃的恒溫水浴鍋中反應60min，隨后用蒸餾水補足至1mL，立即置于100℃的沸水中煮沸2min，終止反應。待試管冷卻至室溫后，各管加入6mLTGO顯色劑于37℃顯色60min，于420nm處測定各管的吸光值�？瞻讓φ罩袠悠访富钍孪冉�(jīng)過煮沸滅活，其它步驟與上述一致。

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