摘要：在微生物層面研究枯梢病與植物針葉內生微生物的互作關系，分析內生真菌的多樣性差異，為松枯梢病的防控提供基礎數據。利用高通量測序技術測定赤松(Pinusdensiflora)不同染病程度的針葉內生真菌的多樣性。結果顯示，隨著病害的加重，P.densiflora針葉內生真菌豐富度呈現出上升的趨勢，多樣性指數表現為先下降后上升的趨勢。無病斑針葉內生真菌中，子囊菌門(Ascomycota)與擔子菌門(Basidiomycota)相對豐度最高，優勢屬為Lapidomyces和Selenophoma，病害導致優勢菌相對豐度的降低。通過對不同染病情況的P.densiflora針葉內生真菌的測定，明確了枯梢病不同發病程度的P.densiflora針葉內生真菌的多樣性及群落結構組成。

　　關鍵詞：赤松;枯梢病;內生真菌;微生物多樣性

　　松枯梢病是世界范圍內針葉樹上最常見和分布最廣的重要病害之一。該病的病原真菌為松球殼孢菌(Sphaeropsissapinea)，主要通過傷口侵染寄主，也可從針葉氣孔侵入或直接侵染嫩梢和嫩葉，越冬芽上潛伏的病菌可導致翌春芽腐和枯梢[1]。Stanosz等[2]對Pinusresinosz和Pinusbanksiana的研究中首次發現無病斑的梢和葉上存在潛伏侵染。劉艷和葉建仁[3]對多個松屬樹種進行套袋隔離的試驗，發現表面無病斑的梢上存在松枯梢病菌進行越冬，可造成來年春梢發病。

　　植物內生微生物在其生活史的一定階段或全部階段定殖于植物的各種組織和器官內部，并與植物建立共生關系，其中的某些類群可以產生各種化學物質，并且能通過競爭或其他作用來抑制或殺死某些致病菌。經Martinez-Klimova統計，在植物中共分離得到具有拮抗活性或可分泌抑菌性代謝物質的內生真菌36屬、內生細菌10屬，其中內生真菌包括Basidiomycota、Ascomycota等，內生細菌包括放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門等[4]。本研究選取無病斑與感染枯梢病的赤松(PinusdensifloraSieb.etZucc.)針葉為研究對象，利用高通量測序技術研究不同枯梢病發病狀態下P.densiflora針葉的內生真菌多樣性以及群落結構的差異，為松枯梢病的微生物防控提供數據基礎。

　　1材料與方法

　　1.1村料

　　1.1.1研究區概況

　　昆崳山(121°41'34''-121°48'04''N，37°11'50''-37°17'49''E)地處山東半島東部，屬暖溫帶季風氣候，林區土壤屬森林棕壤，以沙質壤土為主。昆崳山是我國和東北亞P.densiflora原生地和天然分布中心，P.densiflora在該區域與落葉闊葉林共同組成地帶性天然次生林植被。共選取3塊樣地，樣地地理坐標及海拔為121°43'35.0″N，37°17'30.9″E，184m;121°45'08.4″N，37°17'37.8″E，124m;121°43'19″N，37°17'30.2″E，290m。樣地立地條件均為中坡位，坡度為17°-26°，林分結構均為針闊混交林，由P.densiflora和麻櫟(QuercusacutissimaCarruth.)構成。

　　1.1.2樣品采集

　　于2018年9月在3塊樣地內進行采樣，分別采集樣地內無病斑P.densiflora上無病斑針葉ZK1與染病P.densiflora上無病斑針葉ZK2、染病較輕針葉ZK3(病斑長度為針葉長度1/2以下)、染病較重針葉ZK4(病斑長度為針葉長度1/2以上)針葉，共4類。采用五點采樣法采集樣本，沖洗晾干后用75%乙醇浸泡1min，無菌水沖洗3次，0.5%次氯酸鈉溶液浸泡2min后，再用無菌水沖洗3次，樣品-20℃保存[5]。將沖洗后的無菌水稀釋至MEA培養基上，以確保針葉外表無真菌殘留，結果部分不再贅述。

　　1.2方法

　　1.2.1內生真菌多樣性測定

　　利用CTAB法對樣本DNA進行抽提，完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測[6]。將DNA樣品在冰上融化后，離心并充分混勻，Nanodrop檢測樣品質量，取30ng進行PCR擴增。PCR擴增體系：DNA樣品，1.0μL;ForwardPrimer(5.0μmol/L)，1.0μL;ReversePrimer(5.0μmol/L)，1.0μL;BSA(2.0ng/μL)，3.0μL;2×TaqPlusMasterMix，12.5μL;ddH2O，6.5μL。進行ITS擴增。ITS1區擴增引物序列為(5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3')和(5'-TGCGTTCTTCATCGATGC-3')。PCR采用TransGenAP221-02：TransStartFastpfuDNAPolymerase，將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。擴增產物采用IlluminaMiseqPE300平臺，并構建Miseq文庫以及Miseq上機測序。

　　1.2.2測序數據處理與分析

　　OTU(Operationaltaxonomicunits)是在系統發生學或群體遺傳學研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元(品系、屬、種、分組等)設置的同一標志。用uclust(Version1.2.22)按照97%相似性將全部序列聚類，去除singleton的OTU，并得到代表序列和OTU表[7]。用usearch按照97%相似性序列進行OTU聚類(不含單序列)，得到代表序列再將其全部序列按照97%相似度比對到OTU上形成OTU列表[8-9]。使用Mothur軟件計算豐富度指數Chao1和多樣性指數Shannon[10]。

　　2結果

　　2.1微生物測序數據及稀釋曲線

　　通過高通量測序技術，在12個樣品中共獲得內生真菌有效序列433814條，共計1196個OTU。各樣品OTU稀釋曲線趨于平坦，樣本的Coverage測序深度指數統計分析結果(內生真菌)，結果顯示采集針葉樣本中覆蓋率均大于99%，說明各樣本中的微生物物種信息被充分檢測，結果能夠代表各類針葉中內生真菌的真實水平。

　　2.2赤松針葉內生真菌的多樣性及群落結構分析

　　根據真菌OTU數目，對樣品中OTU組成進行分析，構建Venn圖和群落結構柱狀圖。Venn圖顯示，針葉中共有相同的OTU393個，占OTU總數的32.86%，4類針葉中特有的OTU數目分別為73、88、87、53個，以ZK2中特有OTU數目最多。

　　樣本內生真菌的Chao1指數和Shannon指數統計分析結果，ZK4的Chao1最高，即測得OTU數最高，其次分別為ZK3(病斑長度為針葉長度二分之一以下的P.densiflora針葉)、ZK1(無病斑P.densiflora上的針葉)、ZK2(染病P.densiflora上的無病斑針葉)，隨著病害的加重，內生真菌豐富度呈現出上升的趨勢。ZK1與ZK2的內生真菌多樣性指數均高于ZK3，而之后ZK4的多樣性指數升高。對1196個OTU序列進行門和綱水平上的歸類，可劃分分屬13個門以及40個綱。

　　在門水平上，Ascomycota占比最高，分別達到89.01%、90.90%、95.29%、95.55%，其次為Basidiomycota，分別占比7.78%、4.82%、1.85%和1.29%，Ascomycota與Basidiomycota為針葉內生真菌中的優勢菌群，且在樣本中的相對豐度存在差異，Ascomycota相對豐度逐漸升高，而Basidiomycota相對豐度占比下降。在綱水平上，內生真菌均以座囊菌綱(Dothideomycetes)相對豐度最高(32.83%-43.12%)，其次相對豐度較高的還有散囊菌綱(Eurotiomycetes)(8.23%-27.83%)，以及豐度較高的unidentified菌類，錘舌菌綱(Leotiomycetes)、星裂菌綱(Arthoniomycetes)在無病斑與染病針葉中均占不同的比例。ZK1、ZK2、ZK3中的Dothideomycetes相對豐度相近，均高于ZK4中所占比例;ZK1中Eurotiomycetes占比最低，Eurotiomycetes相對豐度隨著病害的嚴重程度而逐漸升高;Leotiomycetes和Arthoniomycetes分別以ZK3、ZK4中占比最高，ZK1、ZK2中相對豐度相近且較低。

　　銀耳綱(Tremellomycetes)和外囊菌綱(Taphrinomycetes)僅在ZK1、ZK2、ZK3中占比大于1%，在ZK4中相對豐度為0。在屬水平上，相對豐度最高的屬為Lapidomyces，其次為Selenophoma，兩個屬的相對豐度均隨著病害的加重而減小。在無病斑針葉ZK1、ZK2中，Rhizosphaera、Fusarium、Myriangium、Genolevuria的相對豐度均高于1%，在染病針葉中相對豐度為0。而染病針葉中特有的屬有Cenangium、Arthrocatena、Trichomerium、Cladosporium、Phaeothecoidea等，其中Phaeothecoidea僅在發病較重的ZK4中占比超過1%。

　　2.3赤松針葉內生真菌Beta多樣性差異分析

　　基于PCA主成分分析樣品間的Beta多樣性差異評估不同染病級別的P.densiflora針葉內生真菌的差異性，結果表明，主成分PC1與主成分PC2的貢獻率分別為24.6%和20.17%，在3個樣地中，同一樣地內的無病斑針葉距離較近，而染病后的樣本ZK4相聚較集中，說明樣地內P.densiflora針葉的內生真菌存在差異，而在枯梢病的侵染下，內生真菌的構成趨于一致。

　　3討論

　　通過高通量測序技術，對針闊混交林內的P.densiflora針葉內生真菌多樣性與群落結構進行分析，結果表明，P.densiflora針葉內生微生物多樣性豐富，無病斑針葉與染病針葉均為優勢真菌為Ascomycota和Basidiomycota，無病斑針葉與染病針葉多樣性、群落結構等方面均存在差異。松枯梢病是針葉樹上最常見和分布最廣的重要病害之一。國內對松枯梢病的研究不僅在病原發生、傳播、侵染、防治等方面[11-12]，而且在病原菌的多樣性、生物學特征等方面均有進展[3，11，13]，此外，近年來通過拮抗菌對病害的控制也取得了較多的成果[14-16]，也證實了可通過對寄主植物的微生物調控，達到控制枯梢病爆發的目的。

　　健康植物組織中的內生真菌群落更加穩定，從而抑制病原菌的發展。張麗娜等[17]通過PDA平板培養法對不同季節內的無病斑山茶及感病山茶葉片內生真菌群落的差異進行了比較，對灰斑病與山茶葉部內生真菌多樣性的關系進行了分析，結果表明：無病斑葉片的內生真菌數量、多樣性、均勻度高于染病葉片，染病程度對葉片內生真菌多樣性等指標的影響顯著。還有研究表明兩個品種染病后的內生真菌變化趨勢也不同，高抗品種內生真菌多樣性逐漸減少，而高感品種多樣性呈現上升的趨勢[18]。有研究對漆樹感染潰瘍病的枝干部內生真菌進行培養，比對不同染病情況、不同部位的真菌多樣性，結果表明無病斑枝干的內生真菌多樣性顯著高于受損傷組織，潰瘍病菌的侵染對內生真菌群落結構的影響顯著[19]。

　　本研究中，內生真菌在無病斑針葉中表現為較高的多樣性，高于染病較輕的針葉，這與先前的研究結論一致，而在染病較重的針葉中多樣性指數再次升高，可能是因為針葉防御侵染的機制被破壞。在病原菌入侵植物組織時，寄主植物的防御機制被破壞，內部平衡被打破，其它病原微生物以及腐生微生物更容易進入植物組織內，使得內部的微生物多樣性升高。

　　在無病斑棉花和黃萎病侵染后的棉花根部內生真菌的研究中，黃萎病侵染后的棉花根部內生真菌多樣性等指標也均高于無病斑植株根部，說明病原菌的侵染提高了棉花內部微生物的多樣性，影響其群落結構[20]。這可能是由于其它病原菌或腐生真菌對染病組織進行了入侵[21]，或是由于觀察到的真菌群落中存在可引發潛伏侵染病原菌的模式[22]。松類樹種的針葉內生微生物分析大都通過純培養法進行，對樟子松、紅松、興安落葉松等樹種的內生真菌或內生細菌進行分離培養，初步證實了松針葉內生微生物的多樣性及其中對內生微生物多樣性的影響因素，如針葉葉齡[23-24]。

　　在P.densiflora的內生真菌研究中[25-26]，分離獲得了Lophodermiumcomplex、Sydowiapolyspora、Hymenulasp.、Sistotremabrinkmannii、Septoriapini-thunbergii、Earliellasp.和Lophodermiumspp.等多株優勢菌株。隨著對內生微生物認識的不斷提高以及研究水平的提升，第二代測序技術已經常用于微生物多樣性的研究中。Bullington和Larkin[6]對針葉樹種內生真菌多樣性進行了研究，對山白松Pinusmonticola針葉進行接種，并通過新一代高通量測序手段對其中的內生真菌多樣性和群落結構的變化進行測定，研究內生真菌相互間的種間競爭、共生模式等，證實了接種真菌與潛在病原菌的相互競爭。

　　本研究結果得到內生真菌的優勢菌為Ascomycota和Basidiomycota。Ascomycota和Basidiomycota均為常見植物內生真菌[27-28]，與先前P.densiflora純培養內生真菌研究[25]結論一致。Rhizosphaera、Fusarium和Myriangium曾在茅蒼術莖、葉中分離發現，是常見的內生真菌[30]。Fusarium不僅是內生真菌，可分泌多種具有研究價值的次生代謝物質[30]，還是多種植物病害的病原菌[31-32]。因此，對于Fusarium需要進一步研究。在染病較重的針葉中特有的數個屬中，Cenangium為常見的松類病害病原菌，該屬被證實與枯梢病病原菌的侵染具有緊密的聯系[33]。

　　4結論

　　在針闊混交林中，P.densiflora葉部內生真菌的多樣性及群落結構組成受到枯梢病侵染的影響，染病前期程度較輕時微生物多樣性降低，在染病后期多樣性指數上升。無病斑針葉中內生真菌的優勢菌為Lapidomyces和Selenophoma，在枯梢病菌的侵染后兩種優勢菌相對豐度均下降，內生真菌群落結構組成趨于一致。本研究明確了枯梢病不同發病程度P.densiflora針葉內生微生物的多樣性及群落結構組成，為松枯梢病的真菌群落結構調控提供了基礎。

　　參考文獻

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　　生物方向論文投稿刊物：《微生物學報》是微生物學領域內學術性期刊，1953年創刊，以微生物學基礎研究和應用基礎研究以及高技術創新為主的核心期刊，反映我國微生物學研究領域中最新成果。