《蚊媒病毒病流行現(xiàn)狀及病原學檢測技術(shù)研究進展》論文發(fā)表期刊：《中國病原生物學雜志》；發(fā)表周期：2021年06期

《蚊媒病毒病流行現(xiàn)狀及病原學檢測技術(shù)研究進展》論文作者信息：曾嘉慶（１９９７－），男，江蘇沛縣人，在讀碩士研究生，主要從事分子病毒學研究。

　　【摘要】 新發(fā)再發(fā)蚊媒病毒病在病原-媒介-宿主之間傳播，引起登革熱、寨卡熱及流行性乙型腦炎等多種流行病，嚴重威脅著人類和動物的生命健康。本文主要總結(jié)了常見蚊媒病毒病流行特征，重點綜述了蚊媒病毒病原學檢測的優(yōu)缺點與適用范圍。

　　【關(guān)鍵詞】 蚊媒病毒病;檢測技術(shù);登革熱;寨卡熱;流行性乙型腦炎;綜述

　　[ Abstract] Emerging and re-emerging mosquito-borne viral diseases spread between pathogens, vectors, and hosts, causing a variety of outbreaks of diseases such as dengue fever, Zika fever, and Japanese encephalitis that seriously threaten the life and health of humans and animals. This paper summarizes the epidemiological characteristics of common mosquito-borne viral diseases, and it reviews the advantages, disadvantages, and applicability of detection of mosquito-borne viral pathogens.

　　[ Key words] mosquito-borne viral diseases; detection technique; dengue fever; Zika fever; Japanese encephalitis; review

　　***蚊媒病毒病(mosquito-borne viral diseases)是由蚊媒病毒引起的在蚊蟲與脊椎動物之間傳播的傳染病。已知有300余種蚊蟲能夠傳播蚊媒病毒，這些病毒通過已感染的蚊子傳播給脊椎動物，再從脊椎動物傳播至吸食其血液的蚊子0。蚊媒病毒病感染人數(shù)超過7億人，每年造成約70萬人死亡，在全球范圍內(nèi)持續(xù)蔓延并造成嚴重的公共衛(wèi)生問題[-3]

　　隨著氣候變暖及城市化進程加快，蚊媒病毒病在世界范圍內(nèi)廣泛流行。由于多數(shù)蚊媒病毒病沒有有效疫苗或特殊治療方法，快速準確的檢測方法對于流行病學調(diào)查、診斷與防控顯得尤為重要。為應(yīng)對蚊媒病毒病潛在的公共衛(wèi)生威脅，本文以登革熱、寨卡熱及流行性乙型腦炎為例闡述了蚊媒病毒病流行現(xiàn)狀，重點綜述了蚊媒病毒的病原學檢測方法。

　　1蚊媒病毒病流行現(xiàn)狀

　　1.1 登革熱 登革熱由登革病毒(Dengue virus，DENV)引起.通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播。DENV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科、黃病毒屬。人感染DENV后出現(xiàn)頭痛、全身肌肉痛、骨關(guān)節(jié)痛、皮疹和持久高熱等癥狀。

　　自1978年在廣東出現(xiàn)首例確診病例后，登革熱在我國東南部的一些沿海省份和云南等地經(jīng)常發(fā)生。2000-2019年，我國登革熱發(fā)病率呈緩慢上升的趨勢，其中2017-2020年登革熱報告病例分別為5 893例、5 136例、22 188例、802例[-5]。以2019年為例，云南發(fā)病率最高(13.40個病例/10萬人口)，其次是廣東(5.33個病例/10萬人口)、重慶(4.55個病例/10萬人口)和福建(4.10個病例/10萬人口)[1]，登革熱主要發(fā)生在每年的夏秋季節(jié)，9月和10月達到發(fā)病高峰。在30-45歲的人群中，登革熱的發(fā)病率最高]。近些年我國輸入病例逐年增長，特別是東南沿海省份數(shù)量多、來源廣，但在西南地區(qū)較為局限，幾乎只來源自東南亞國家[，有學者對杭州西湖區(qū)越冬的白紋伊蚊卵進行檢測，結(jié)果顯示DENV陽性率達到了8.33%[a一方面，這提示DENV可能會存在垂直傳播的風險;另一方面，檢測結(jié)果也表明伊蚊卵已成為DENV抵抗不利條件的潛在生存媒介。為了預(yù)測登革熱潛在爆發(fā)的風險，可以通過對其傳播媒介的密度、感染率進行監(jiān)測。劉小波等0分析了2019年我國23個省(自治區(qū)、直轄市)媒介伊蚊監(jiān)測數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)伊蚊密度超過了登革熱傳播閾值，說明當前登革熱爆發(fā)風險較高。

　　1.2 寒卡熱 寨卡熱是由黃病毒科、黃病毒屬的寨卡病毒(Zir ka virus，ZIKV)引起的蚊媒病，ZIKV分為亞洲型和非洲型，通過伊蚊傳播、母嬰傳播和性傳播，提示ZIKV有人際傳播的潛力，這在黃病毒中是特有的[1]，與登革熱相比，賽卡熱的癥狀較為溫和，其典型癥狀是發(fā)燒(多為中低度發(fā)熱)、斑丘疹、全身乏力、關(guān)節(jié)痛和非化膿性結(jié)膜炎等。

　　ZIKV于1947年首先在東非烏干達的恒河猴體內(nèi)成功分離[1]。2013-2014年，法屬波利尼西亞爆發(fā)了寨卡熱疫情，重癥病例表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)疾病和自身免疫疾病，如Guillan-Barre綜合征[2]，2015年以來美洲持續(xù)出現(xiàn)了由于先天感染ZIKV引起的小頭畸形嬰兒的病例[3]。最新研究表明，美洲爆發(fā)造成的大規(guī)模疫情可能是由于ZIKV囊膜蛋白突變繼而使得其神經(jīng)毒力增強與病毒血癥加重[1]，自2016年2月我國報道了首例寨卡熱病例以來，已經(jīng)發(fā)生了至少29起輸入性病例[1]

　　Jia等[6]從委內(nèi)瑞拉返回的中國人員中檢測出ZIKV陽性，并在人員所處的社區(qū)中發(fā)現(xiàn)了伊蚊或其幼蟲。這表明ZKV有可能二次傳播，提示需要對進出寨卡熱流行國家的人員加大防護宣傳和監(jiān)測力度。ZIKV與DENV都通過伊蚊進行傳播，有研究發(fā)現(xiàn)ZIKV對伊蚊傳播DENV具有可能的促進作用[1]

　　ZIKV不僅通過伊蚊傳播，有學者在致倦庫蚊和騷擾阿蚊中分離出了ZIKV，分析表明ZIKV分離株與美洲流行的毒株具備相同的分子基礎(chǔ)，提示應(yīng)做好寨卡熱流行與蔓延的防控工作[3]。

　　1.3 流行性乙型腦炎 流行性乙型腦炎又稱日本乙型腦炎，簡稱乙腦，是由流行性乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis vir rus，JEV)引起的蚊蟲傳播的人獸共患病。JEV在亞太地區(qū)廣泛存在，主要通過庫蚊(以三帶喙庫蚊為主)傳播，豬和部分水禽(如白鷺)是其中間宿主。庫蚊在潮濕的稻田和豬場較為常見，而我國作為稻田種植和豬肉生產(chǎn)大國，面臨著蚊媒病毒病的嚴重威脅。JEV主要感染15歲以下的兒童，在人體表現(xiàn)為輕度的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括驚厥、意識障礙等。乙腦的癥狀嚴重程度主要與畜齡有關(guān)，仔豬會發(fā)展成非化膿性腦炎，成年豬多表現(xiàn)為生殖障礙，如流產(chǎn)和短暫不育。

　　隨著乙腦疫苗免疫接種的普及，人群發(fā)病率總體呈下降趨勢。乙腦的發(fā)病率從2000年的0.95個病例/10萬人口逐步下降到2019年的0.03個病例/10萬人口以下，當前以云南、甘肅和四川的發(fā)病率最高[4.1]。乙腦主要發(fā)生在每年的6-11月份，

　　7-9月份達到發(fā)病高峰。乙腦疫苗納入常規(guī)免疫后，15歲以下高發(fā)群體的發(fā)病率下降，但是乙腦發(fā)病年齡段后移，以50歲以上人群發(fā)病最多。這提示在保證適齡兒童高接種率的基礎(chǔ)上，針對高發(fā)群體開展有針對性的預(yù)防接種工作是十分必要的。以乙腦為代表的人獸共患病毒病在家畜間傳播較為廣泛。人是JEV的終末宿主，豬是JEV的主要傳染源與中間宿主，雞、鴨、牛、馬、驢、騾等畜禽是JEV的儲存宿主。豬源JEV在我國云南、廣西、廣東、福建、湖南、四川、河南、遼寧和內(nèi)蒙古等省份均有發(fā)現(xiàn)。研究人員從遼寧地區(qū)豬血清樣本中分離出JEV，該毒株與疫苗株相比有位點突變，這為疫苗研發(fā)提供了參考[21

　　Liu等[2]在云南邊境居民區(qū)的庫蚊和仔豬均發(fā)現(xiàn)JEV陽性，并對庫蚊和仔豬的毒株序列進行全基因組測序，分析發(fā)現(xiàn)兩者均存在一定程度的進化變異。這既說明JEV在庫蚊及豬之間能夠有效傳播，也提示當?shù)氐腏EV疫苗可能無法對人群及豬提供完全保護。

　　2蚊媒病毒病原學檢測技術(shù)

　　2.1 蚊媒病毒分離培養(yǎng) 樣品中分離培養(yǎng)出蚊媒病毒是實驗室檢測的金標準。蚊媒病毒分離培養(yǎng)分為動物接種、蚊蟲接種或敏感細胞接種。動物接種是最原始的病毒分離方法，可以在易感動物體內(nèi)收獲大量毒液，乳鼠腦內(nèi)接種已成功分離出ZIKV，DENV及JEV，蚊蟲接種較為少見，但也分離培養(yǎng)出了ZIKV，DENV，JEV及基孔肯雅病毒(Chikungunya virus.CHIKV)等。敏感細胞分離病毒較為常用，通過觀察敏感細胞病變，以此初步判斷樣品是否含有蚊媒病毒。細胞分離優(yōu)勢體現(xiàn)在能夠同時對樣品中的多個蚊媒病毒進行分離，甚至是前人未發(fā)現(xiàn)的病毒，還能夠長期保存病毒毒株以便后續(xù)實驗。近年來，研究人員己分離出ZIKV，DENV和JEV，但分離培養(yǎng)操作周期長，如樣品病毒含量少，細胞病變往往不明顯，需盲傳多代。病毒種屬也不易判斷，還要與核酸檢測結(jié)合進一步驗證，這會延長實驗周期。

　　2.2 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR(quantitative reahtime PCR，qPCR)克服了常規(guī)PCR易污染和無法定量檢測的不足，具有特異性好、靈敏度高、結(jié)果可靠、定量準確的優(yōu)點。例如，基于DENV的qPCR檢測方法，其靈敏度是常規(guī)PCR的10"倍，而且特異性較好，與JEV，CHIKV無交叉反應(yīng)[2]，不僅如此，有研究學者建立了檢測ZIKV和DENV的多聯(lián)qPCR方法，該方法能夠在癥狀相似的蚊媒病毒病的流行地區(qū)進行鑒別檢測[3]。目前，qPCR法在DENV，ZIKV，JEV，CHIKV、西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)、黃熱病毒(Yellow Fever vi-rus，YFV)、裂谷熱病毒(Rift Valley Fever virus，RVFV)等多種蚊媒病毒的病原檢測中發(fā)揮重要作用。但因該法對實驗設(shè)備及操作環(huán)境的高度要求，使得該法局限于實驗室內(nèi)檢測。

　　2.3 多重PCR 多重PCR(multiplex PCR，mPCR)技術(shù)是由常規(guī)PCR發(fā)展而來，將多組特異性引物加至同一PCR體系中，實現(xiàn)一次擴增達到多種病原的檢測，在混合感染的鑒別診斷中具有顯然易見的優(yōu)勢。在蚊媒病毒檢測中，蚊蟲樣品往往存在多種病毒混合感染，mPCR技術(shù)可在有限時間內(nèi)實現(xiàn)多種病毒快速檢測。例如，徐煥洲等[2]使用mPCR技術(shù)對蚊子樣品實現(xiàn)了JEV，ZIKV，DENV及WNV等5種蚊媒病原的快速檢測。mPCR建立的關(guān)鍵之一在于調(diào)整已知含量的樣品核酸來平衡多引物濃度。為解決此問題，Sint等[2]建立了標準化核酸模板，平衡了多引物均勻擴增并提高了多病原檢測的靈敏度。mPCR還需要對前期的多引物設(shè)計、反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進行摸索篩選，該過程不可避免的會耗費大量時間。在實際應(yīng)用中，mPCR與qPCR技術(shù)經(jīng)常結(jié)合使用以建立多重QPCR來檢測蚊媒病毒。

　　3展望

　　蚊媒病毒每年感染數(shù)百萬人，對公共衛(wèi)生的威脅持續(xù)上升。我國蚊媒病毒病正在由南向北擴大，病毒潛在的變異，國外輸入態(tài)勢嚴峻，且缺乏有效治療手段，應(yīng)對蚊媒病毒病在時間和空間內(nèi)的流行情況及現(xiàn)有流行的和新出現(xiàn)基因型的動態(tài)變化情況進一步追蹤研究。

　　豐富檢測技術(shù)的多樣性，提高檢測技術(shù)的檢出效率對防控蚊媒病毒病的爆發(fā)與傳播具有重要意義，因此傳統(tǒng)檢測技術(shù)的優(yōu)化與新檢測技術(shù)的研發(fā)迫在眉睫。第一，當單一感染或混合感染時，鑒別診斷是當前要面對的難題，檢測方法應(yīng)當考慮到這個重要因素。第二，檢測技術(shù)在保證高特異性、靈敏度的基礎(chǔ)上，還要朝著簡便快速準確便攜低廉的方向發(fā)展。第三，通過研究生物菌群與氣候環(huán)境因素對蚊蟲的生理影響及病原-媒 介-脊椎動物-人之間的相互關(guān)系，對于更好地理解蚊媒病毒的病原學特征、進化變異規(guī)律以及檢測技術(shù)的建立、如何科學防控蚊蟲提供了新的角度。

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