摘 要：【目的】為了解決百合在北方鹽堿地區(qū)百合種球生長和產(chǎn)量的問題。【方法】以 OT型百合 ‘Robina’為 材料，克隆了百合液泡膜鈉氫逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因 (LoNHX2)，并使用前期試驗得出的半致死濃度200mM NaCl 對百合種球進行處理，通過熒光定量分析百合LoNHX2基因在鹽處理后不同時間及不同部位的表達狀況。 【結 果】結果表明：(1)百合LoNHX2基因全長為1608bp，編碼525個氨基酸; (2)百合 LoNHX2蛋白性質(zhì)穩(wěn) 定，由20種氨基酸組成，為脂溶性蛋白;(3)200mM NaCl對百合種球根系進行鹽脅迫處理后，LoNHX2基 因在百合根部的表達量隨時間變化，呈先上升再下降趨勢;(4)對百合盛花期不同部位中LoNHX2基因表達量 分析，LoNHX2基因在花瓣中表達量最高，其次是葉片、莖、根，表達量最低的是鱗莖。 【結論】發(fā)現(xiàn)百合 LoNHX2基因在鹽脅迫中有重要作用，可通過降低細胞質(zhì)中 Na+ 的濃度，從而降低高鹽脅迫對植物細胞的傷 害。為百合種球耐鹽分子育種提供理論依據(jù)，對百合在北方產(chǎn)業(yè)化發(fā)展及園林應用方面具有重要意義。

　　關鍵詞：百合;鹽脅迫;LoNHX2;基因克隆

　　百合多數(shù)品種喜微酸性土壤，但北方地區(qū)的土 壤偏堿，對百合根系造成持續(xù)鹽堿脅迫，嚴重影響 種球生長和產(chǎn)量。目前對百合鹽脅迫的研究主要 集中在生理生化特性研究，有報道0.8%～0.9%的 NaCl可能是百合所承受的最大鹽脅迫濃度[1];劉艷 妮等在1%鹽濃度脅迫下對亞洲百合進行抗鹽性突 變體篩選，得到抗鹽性誘變百合植株[2-3];左志銳等 比較2個百合的葉綠體和線粒體的超微結構，研究 了品種'Sorbonne'和'Prato'在 低 鹽 處 理 下 的 結 構 變化[4]。

　　轉(zhuǎn)運蛋白在營養(yǎng)物質(zhì)攝取、代謝產(chǎn)物釋放以及 信號轉(zhuǎn)導等廣泛的細胞活動中起著重要的作用[5]。 已有研究表明植物體內(nèi)存在多個與 Na+ 轉(zhuǎn)運相關 的蛋白，如液泡膜上的 Na+/H+ 逆向轉(zhuǎn)運蛋白(vac- uolarNa+/H+ antiporter/exchanger，NHX)和 細 胞質(zhì) 膜 上 的 Na+/H+ 逆 向 轉(zhuǎn) 運 蛋 白 (SaltOverly Sensitive，SOS)[5]。液 泡 膜 NHX 蛋 白 主 要 行 使 Na+ 在液泡中區(qū)域化的功能，在提高植物耐鹽性方 面發(fā)揮了重要作 用[6]。

　　He等 將 擬 南 芥 AtNHX1 轉(zhuǎn)入棉花后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因棉花能在高濃度 NaCl條 件下正常生長[7]。目前，NHX2基因研究較多，已 在擬 南 芥[8]、羽 衣 甘 藍[9]、番 茄[10]、小 麥[11]、大 葉 藻[12]等多種植物中克隆出來，并做了進一步研究。 另外，NHX 基因在轉(zhuǎn)基因植物擬南芥、番茄、茄果 和水稻中也證實了耐鹽性的改善[8]，但 NHX 基因 在百合中尚少有相關研究。

　　百合為鹽敏感植物，土壤鹽堿化現(xiàn)象一直是困 擾百合種植生產(chǎn)的重要問題，研究百合鹽脅迫機理 及其耐鹽適應性，在理論和應用方面都具有重要意 義。就此以 OT 型(東方百合與喇叭百合系間雜種) 百合‘Robina’為材料，用200mM NaCl對百合種球 進行處理，分析百合 LoNHX2基因在不同時間及 不同部位的表達狀況，為研究百合鹽脅迫下的基因 表達調(diào)控機理奠定了基礎。

　　1 材料與方法

　　1.1 植物材料

　　采用 OT 型百合品種‘Robina’為材料，取若干 種球種于北京農(nóng)學院實驗基地溫室內(nèi)，生長期間進 行常規(guī)管理，待生長30d后，用200mM NaCl溶液 對種植30d的百合進行處理，分別取處理后的0、6 h、12h、24h的百合根系，同時，取常規(guī)培養(yǎng)的盛花 期百合的根、莖、葉、花瓣、鱗莖，以上材料包上錫箔 紙快速放入液氮中備用。

　　1.2 百合 RNA的提取及cDNA的合成 使用 植 物 RNA 快 速 提 取 試 劑 盒 (EASYspin Plus，艾德萊)提取根系樣品的總 RNA，用反轉(zhuǎn)錄試 劑盒(TaKaRa)合成cDNA，最后用紫外核酸蛋白測 定儀調(diào)節(jié)cDNA 模板濃度至基本一致。采用1.2% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。

　　1.3 百合LoNHX2基因的克隆 根據(jù)課題組前期已有的百合轉(zhuǎn)錄組測序結果 中的非重復序列基因unigene，查找 LoNHX2基因， 對 LoNHX2基因的 unigene進行序列比對發(fā)現(xiàn)5′ 端較 完 整，3′端 有 缺 失。 參 照 3-′RACE 試 劑 盒 (TaKaRa)操作步驟分別進行 3′RACE 擴增，設計 3′RACE 特 異 性 引 物 3′GSP (GAAAAGTG- GAGATTTGTCAGCA)和 3′ NGSP (AATC- CCTATTTTCGTCGCTCAT)，并測序，通過DNA- MAN 軟件拼 接，獲 得 LoNHX2 基 因 全 長 cDNA。 再根據(jù)最大開放閱讀框設計上游引物 LoNHX2-F (ATGGGTATCGATTTGGAGCCGG)和下游引物 LoNHX2-R(TCATTCCCATTCAGGGACGCTT )，以 cDNA 為模板進行 PCR 擴增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳，用 DNA 回收試劑盒(TaKaRa)進行切膠 回收，用pMD19-TVector連接轉(zhuǎn)化并測序。

　　2 結果與分析

　　2.1 百合根系總 RNA提取質(zhì)量分析

　　對提取的百合根系總 RNA 進行瓊脂糖凝膠電 泳，電泳條帶完整，可用于后續(xù)試驗。

　　2.2 百合LoNHX2基因3’RACE克隆 在課題組前期進行的轉(zhuǎn)錄組測序結果中已有 的 LoNHX2 unigene 序 列 的 基 礎 上，經(jīng) 過 3’- RACE 后，將 目 的 條 帶 進 行 切 膠 回 收、pMD19-T Vector連接轉(zhuǎn)化及菌液測序，得到1條501bp條帶 。

　　3 結論與討論

　　本 研 究 根 據(jù) 轉(zhuǎn) 錄 組 測 序 中 已 知 的 百 合 LoNHX2基因片段序列，設計3’端引物，通過巢式 PCR擴增，克隆得到大小為 501bp的 3’端序列。 將克隆 得 到 的 3’端 序 列 與 已 知 序 列 拼 接，得 到 LoNHX2基因全長cDNA 序列，在最大開放閱讀 框 ORF外設計全長特異性引物，經(jīng)過 PCR 擴增得 到大小為1608bp的全長序列，其中包括起始密碼 子 ATG 和 終 止 密 碼 子 TGA，共 編 碼 525 個 氨 基 酸。

　　用 DNAMAN 軟件將其翻譯為蛋白序列后發(fā) 現(xiàn)，百合 LoNHX2 蛋白的分子式為 C2751H4267N677 O736S28，相對分子量為59498.92，理論等電點(PI) 為7.27，該蛋白為脂溶性蛋白、穩(wěn)定蛋白。LoNHX2 蛋白由20種氨基酸組成，蛋白由內(nèi)向外有11個跨 膜螺旋，由外向內(nèi)有12個跨膜螺旋，無信號肽。二 級結構中，α-螺旋(Alphahelix)和延伸鏈(Extended strand)所占比例最多。LoNHX2蛋白序列與擬南 芥、水 稻、玉 米 相 似 度 分 別 為 90.51%、89.42%、 90.69%。在獐毛中，用400mM NaCl處理6h后，根部 AINHX1基因的的表達量相對于莖部明顯升高， 說明根部對鹽脅迫更敏感。

　　在處理6h和12h時， 根部AINHX1基因的的表達量比對照 CK 分別上 升了6倍和8倍，處理24h后表達量降低[13]。本試 驗結果與這一致。本試驗中，在200mM NaCl處理 后，LoNHX2基因在百合根部的表達量呈先上升 再下降趨勢。

　　園藝論文投稿刊物：《園藝學報》是中國園藝學會主辦的學術性期刊，刊登果樹、蔬菜、西瓜甜瓜和觀賞植物等方面示曾發(fā)表過的學術論文、研究報告、研究簡報、專題文獻、綜述，經(jīng)過審定或鑒定的新品種、新書介紹、學術活動信息等。

　　在處理0、3、6、12h時表達量逐漸升 高，處理24h時表達量降低。此外，在大麥[14]、水 稻[15]、灰綠狼尾草[16]中有相似的表達狀況。說明 LoNHX2基因在植物鹽脅迫中有重要作用，可降低 細胞質(zhì)中 Na+ 的濃度，從而降低高鹽脅迫對植物細 胞的傷害。 在百合不同部位 中，LoNHX2 基 因 在 花 瓣 中 表達量最高，其次是葉片、莖、根，表達量最低的是 鱗莖，說明LoNHX2基因的表達具有普遍性，在不 同部位表達差異量較大。這可能與在百合盛花期 時采集樣 品 有 關，盛 花 期 時 花 瓣 中 各 細 胞 較 為 活 躍、代謝旺盛，所以 LoNHX2表達量較高，與此同 時葉片、莖等組織部位均已處于成熟期，所以表達 量較低。本研究克隆了百合 LoNHX2基因序列， 并分析了百合LoNHX2基因在不同時間及不同部位的表達狀況，發(fā)現(xiàn)了LoNHX2基因的表達規(guī)律， 為研究百合鹽脅迫下的基因表達調(diào)控機理提供了 理論參考。

　　參考文獻：

　　[1] 華智銳.百合對鹽脅迫的生理反應及轉(zhuǎn)S6PDH 基因植株的抗 鹽性鑒定[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2007.

　　[2] 劉艷妮，王飛.百合離體抗鹽變異體的篩選及生理特性研究 [J].西北林學院學報，2010，25(2)：70-75.

　　[3] 左志銳，高俊平，穆鼎，等.鹽脅迫下百合兩個品種的葉綠體和 線粒體超微結構比較[J].園藝學報，2006(2)：429-432.

　　[4] YAMAGUCHIT，HAMAMOTO S，UOZUMI N.Sodium transportsysteminplantcells[J].FrontiersinPlantScience， 2013，4：410.

　　[5] XU H X，JIANG X Y，ZHAN K H，etal.Functionalcharac- terizationofawheatplasmamembraneNa+/H+ antiporter inyeast[J].ArchivesofBiochemistryandBiophysics，2008， 473：8-15.

　　[6] YOKOIS，QUINTERO FJ，CUBERO B，etal.Differential expressionandfunctionofArabidopsisthaliana NHX Na+/ H+ antiportersinthesaltstressresponse[J].PlantJournal， 2002，30：529-539

　　作者：王安琪，薛曉霞，左 楊，張克中，崔金騰