摘要為了培育優(yōu)質(zhì)茅蒼術(shù)種質(zhì)資源，提高茅蒼術(shù)藥材品質(zhì)，本研究以茅蒼術(shù)植株為材料，通過(guò)接種枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、膠質(zhì)芽孢桿菌Bacillusmucilaginosus以及細(xì)黃鏈霉菌Streptomycesmicroflavus的方法，考察不同菌株對(duì)其生長(zhǎng)特性、主要藥效成分積累及其關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種種菌株均在不同程度促進(jìn)了茅蒼術(shù)的生長(zhǎng)，過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性和葉綠素含量，以接種膠質(zhì)芽孢桿菌組對(duì)蒼術(shù)苗的作用最明顯，這組的株高、莖粗、根長(zhǎng)、根鮮質(zhì)量及根干質(zhì)量較對(duì)照組分別增長(zhǎng)了23.0%、28.9%、24.2%、34.8%和39.0%，抗氧化酶活性和葉綠素含量與對(duì)照組的差異也達(dá)到顯著水平;接種膠質(zhì)芽孢桿菌組羥基甲基戊二酸單酰輔酶還原酶(HMGR)、法呢基焦磷酸合酶(FPPS)和乙酰輔酶羧化酶(ACC)基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著增加，而另兩組只有HMGR和ACC相對(duì)表達(dá)量明顯增加。這表明不同的菌株對(duì)茅蒼術(shù)的促生作用不一，我們的研究結(jié)果為人工調(diào)控茅蒼術(shù)的栽培生產(chǎn)實(shí)踐提供科學(xué)依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞茅蒼術(shù);細(xì)菌接種;抗氧化酶;藥效成分;關(guān)鍵酶基因

　　茅蒼術(shù)Atractylodeslancea(Thunb.)DC.)為菊科Asteraceae蒼術(shù)屬AtractylodesDC.)多年生草本植物，其干燥根莖入藥即為“蒼術(shù)”蔣玲等,2017)。茅蒼術(shù)中主要包含蒼術(shù)酮、β桉葉醇等倍半萜類成分，還有蒼術(shù)素等聚乙炔類成分徐曉蘭等,2007)。茅蒼術(shù)作為江蘇省著名道地藥材，近年來(lái)由于對(duì)其野生資源的掠奪和生態(tài)環(huán)境的破壞，還有其自身原因，茅蒼術(shù)野生資源已瀕臨滅絕歐陽(yáng)麗敏等,2020)。

　　雖然目前通過(guò)人工栽培在一定程度上可以解決茅蒼術(shù)資源短缺的問(wèn)題，但仍然存在活性成分含量低于原產(chǎn)區(qū)的問(wèn)題陳飄雪等,2020)，如何提高栽培地區(qū)茅蒼術(shù)品質(zhì)是目前重要的研究方向之一。植物主要通過(guò)甲羥戊酸(mevalonatepathway,MVA)途徑合成倍半萜類成分，而有兩個(gè)酶在此途中起重要作用(Qianetal.,2017)。其一為羥基甲基戊二酸單酰輔酶還原酶(3hydroxymethylglutaryl coenzymeA,HMGR)，HMGR主要催化MVA的生成(Bhambhanietal.,2017)。

　　其二為法呢基焦磷酸合酶(farnesylpyrophosphatesynthase,FPPS)，F(xiàn)PPS催化生成倍半萜類化合物的前體法呢基二磷酸(farnesyldiphosphate,FPP)。蒼術(shù)素屬于聚炔類成分，而聚炔類化合物的生物合成與脂肪酸類似陶金華等,2014)，其中乙酰輔酶羧化酶(acetylcoenzymeAcarboxylase,ACC)是脂肪酸及聚炔類化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。ACC的表達(dá)容易受到外界因子的影響，如真菌誘導(dǎo)子可使ACC的表達(dá)顯著增強(qiáng)FigueroaBalderasetal.,2017)。植物根際存在大量微生物，它們作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的主要推動(dòng)者，可以很大程度促進(jìn)藥用植物的生長(zhǎng)，提升藥用植物的品質(zhì)。

　　近年來(lái)，關(guān)于藥用植物微生物互作的研究越來(lái)越多，也有越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始嘗試用微生物促進(jìn)開(kāi)發(fā)植物資源。而微生物可以直接或間接作用于植物，對(duì)于調(diào)控藥用植物生長(zhǎng)、影響其適應(yīng)環(huán)境的能力、提高其有效成分的含量等方面都有重要的作用彭政等,2020)。已有學(xué)者在這方面對(duì)茅蒼術(shù)進(jìn)行了研究，梁雪飛等(2018)在溫室條件下研究三種叢枝菌根真菌對(duì)茅蒼術(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育與藥效成分積累的影響，篩選出G.mosseaeBGCAM0045可作為茅蒼術(shù)苗菌根化處理的優(yōu)良菌株。陳飄雪等(2020)將內(nèi)生菌復(fù)合接種于茅蒼術(shù)，探究其對(duì)于茅蒼術(shù)生長(zhǎng)和倍半萜積累的影響。

　　但尚未有學(xué)者從土壤細(xì)菌的角度研究其對(duì)茅蒼術(shù)的促生作用。本研究選擇土壤中的有益菌株：枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis、膠質(zhì)芽孢桿菌Bacillusmucilaginosus以及細(xì)黃鏈霉菌Streptomycesmicroflavus作為供試菌株進(jìn)行研究。枯草芽孢桿菌是植物根際促生細(xì)菌(PGPR)的主要菌類之一，其會(huì)產(chǎn)生各類代謝物質(zhì)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)植株抗性繼而抵抗病蟲(chóng)害李怡潔和楊佐忠,2019)。研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌能提高黨參的發(fā)芽、根長(zhǎng)、分枝等生長(zhǎng)指標(biāo)(Wuetal.,2016)。

　　膠質(zhì)芽孢桿菌是一類能分解土壤和硅酸鹽礦物的化能異養(yǎng)型好氧菌，土壤中難以利用的鉀、磷元素都可以被此菌變?yōu)橛行р洝⒘祝�以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育田稼等,2017)。細(xì)黃鏈霉菌為鏈霉菌屬，不僅能增強(qiáng)植物抗病性，還能促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，提高作物產(chǎn)量李堆淑和冀玉良,2018)。本研究選取三種有益菌株接種于茅蒼術(shù)種苗，旨在模擬茅蒼術(shù)的原生境，探索其對(duì)茅蒼術(shù)的生長(zhǎng)特性、主要藥效成分的變化以及HMGR，F(xiàn)PPS，ACC等關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，考察不同菌株對(duì)茅蒼術(shù)的促生作用以及對(duì)藥效成分積累的影響，為人工調(diào)控茅蒼術(shù)的栽培生產(chǎn)實(shí)踐提供科學(xué)依據(jù)。

　　1結(jié)果與分析

　　1.1不同菌株對(duì)茅蒼術(shù)種苗生長(zhǎng)的影響

　　與對(duì)照組相比，Bacillussubtilis處理組(A1)、Bacillusmucilaginosus處理組(A2)的株高、莖粗、根長(zhǎng)均有顯著提高(P<0.05)。而Streptomycesmicroflavusvar.Lactosus處理組(A3)的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)則沒(méi)有顯著性的提高。A2處理組的株高、莖粗、根長(zhǎng)、根鮮質(zhì)量及根干質(zhì)量較對(duì)照組分別增長(zhǎng)了23.0%、28.9、24.2%、34.8%和39.0%，其根冠比也有顯著性提高。茅蒼術(shù)種苗的生長(zhǎng)在接種種菌株后均得到了促進(jìn)，其中，A2處理組效果最佳，其次為A1和A3處理組表。

　　1.2不同菌株對(duì)茅蒼術(shù)種苗抗氧化酶活性的影響

　　實(shí)驗(yàn)處理0d時(shí)，各處理組之間抗氧化酶系活性幾乎沒(méi)有差異。在接種三種菌株后，茅蒼術(shù)的SOD、CAT、POD酶活性均有提高 。而A1、A2處理組對(duì)三個(gè)酶活性均影響較為顯著，其中SOD酶活性峰值分別為同期對(duì)照組水平的118%和137%，SOD酶活性分別在14d(A1)、14d(A2)和21A3)達(dá)到峰值;CAT酶活性的峰值分別為同期對(duì)照組水平的154%和148%，CAT酶活性分別在7d(A1)、14d(A2)和14d(A3)達(dá)到峰值;POD酶活性峰值則分別為同期對(duì)照組水平的106.8%和108.5%，POD酶活性均在14d達(dá)到峰值。與此同時(shí)，A3處理組的影響并不顯著。結(jié)果表明，接種種細(xì)菌均能影響茅蒼術(shù)幼苗的抗氧化酶系的活性，其中A2處理組的影響最為明顯。

　　2討論

　　本實(shí)驗(yàn)共測(cè)定了種供試菌株對(duì)茅蒼術(shù)生長(zhǎng)特性的影響，其中枯草芽孢桿菌以及膠凍樣類芽孢桿菌為根際促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria,PGPR)，它們是天然存在于土壤并定殖于植物根際的微生物，不僅能改善土壤理化性質(zhì)，還可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)植物抗逆性等郭鳳仙等,2017)。

　　這兩個(gè)處理組的茅蒼術(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育均得到了促進(jìn)，可能是因?yàn)镻GPR通過(guò)包括固氮、溶磷、解鉀、溶鐵、分泌植物激素及相關(guān)調(diào)控物質(zhì)和釋放揮發(fā)性物質(zhì)等機(jī)理促生孫韻雅等,2020)。而第三種細(xì)黃鏈霉菌是鏈霉菌屬放線菌，它也促進(jìn)了茅蒼術(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育，可能是其通過(guò)作為菌肥，轉(zhuǎn)化土壤中氮磷元素提高土壤肥力，刺激茅蒼術(shù)生長(zhǎng)譚之磊等,2008)。正常生長(zhǎng)條件下，植物體內(nèi)抗氧化酶系保持一定的活性，共同協(xié)作下清除多余的ROS(王玉卓等,2020)。

　　SOD、CAT、POD作為抗氧化酶系中的主要酶類，在正常及逆境情況下，活性會(huì)升高，及時(shí)清除植物體內(nèi)活性氧，提高植物的抗逆性班甜甜等,2018)。而之前也有文獻(xiàn)報(bào)道，接種叢枝菌根真菌會(huì)對(duì)茅蒼術(shù)的生理活性產(chǎn)生顯著的影響梁雪飛等,2018)。本實(shí)驗(yàn)在接種三種菌株后，發(fā)現(xiàn)茅蒼術(shù)的SOD、CAT、POD酶活性均有提高，其中A2處理組的影響最為明顯，其SOD、CAT、POD酶活性分別為同期對(duì)照組水平的137%、154%和108.5%，表明接種供試菌株可以調(diào)節(jié)抗氧化酶活性，在一定程度上提高茅蒼術(shù)的生理代謝能力和應(yīng)對(duì)脅迫能力。

　　葉綠素含量是判斷植物光合作用強(qiáng)弱的指針，植物葉片衰老時(shí)葉綠素占比呈下降趨勢(shì)，而IAA、CTK則可以抑制與延緩植株葉片的衰老，使葉綠素始終占比較高。接種促生菌可以提高宿主植株吲哚乙酸及赤霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)而提高葉綠素含量丁新景等,2016)。本研究的結(jié)果表明，三種供試菌株均提高了茅蒼術(shù)的葉綠素總量，其中A1、A2處理組提高較顯著，可能是通過(guò)提高茅蒼術(shù)吲哚乙酸及赤霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)而增加葉綠素含量，提高植物光合效率，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。HMGR被認(rèn)為是MVA途徑上的第一個(gè)限速酶，其表達(dá)量的多少?zèng)Q定著許多有效藥用活性成分產(chǎn)量的多少(Vranováetal.,2013)。

　　本實(shí)驗(yàn)中，盡管各處理組接種不同菌株后，對(duì)兩個(gè)關(guān)鍵酶基因相對(duì)表達(dá)量影響各不相同，但各組HMGR關(guān)鍵酶基因相對(duì)表達(dá)量都上調(diào)，其β桉葉醇和蒼術(shù)酮含量也上升了。而FPPS作為MVA途徑中另一個(gè)重要酶，其表達(dá)量的多少也顯著影響了倍半萜類成分的生物合成(Guoetal.,2014)。

　　各處理組的β桉葉醇和蒼術(shù)酮含量變化趨勢(shì)與FPPS表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致，A1與A3處理組FPPS相對(duì)表達(dá)量基本持平，沒(méi)有顯著性差異，A2處理組FPPS相對(duì)表達(dá)量顯著增加，A2處理組的β桉葉醇和蒼術(shù)酮含量顯著高于另外兩組，說(shuō)明關(guān)鍵酶基因HMGR、FPPS表達(dá)量與β桉葉醇和蒼術(shù)酮的含量緊密相關(guān)陸奇杰等,2019)。ACC作為聚炔類成分生物合成路徑上的關(guān)鍵酶，其相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與蒼術(shù)素基本一致，說(shuō)明ACC表達(dá)量與蒼術(shù)素的含量緊密相關(guān)。

　　蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮和β⁃桉葉醇是茅蒼術(shù)的主要藥效成分，常被作為茅蒼術(shù)的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。β⁃桉葉醇為蒼術(shù)倍半萜類代表成分，具有調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)、抗胃潰瘍、降血糖、保護(hù)肝臟和抗菌等作用吳佳新,2016,江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),44(3):2830)。而接種三種供試菌株提高了茅蒼術(shù)中種主要藥效成分的含量，尤其是A2處理組，不僅對(duì)β⁃桉葉醇的積累有明顯促進(jìn)作用，其對(duì)三種成分均具有明顯的促進(jìn)積累的作用，極大地提高了茅蒼術(shù)的品質(zhì)。

　　本研究選擇了三組供試菌株將其接種于茅蒼術(shù)幼苗，通過(guò)分析茅蒼術(shù)幼苗的生長(zhǎng)特性、主要藥效成分積累和關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響來(lái)分析這三種菌株的效果。結(jié)果表明，不同的菌株對(duì)茅蒼術(shù)的促生作用不一，A2處理組的Bacillusmucilaginosus菌株對(duì)于促進(jìn)茅蒼術(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育，提高茅蒼術(shù)的品質(zhì)具有顯著的影響。本研究期望為茅蒼術(shù)優(yōu)質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和可持續(xù)性利用使用菌劑提供應(yīng)用基礎(chǔ)，為人工調(diào)控茅蒼術(shù)的栽培生產(chǎn)實(shí)踐提供研究依據(jù)。

　　生態(tài)學(xué)評(píng)職知識(shí)：生態(tài)學(xué)論文審稿時(shí)間長(zhǎng)不長(zhǎng)

　　3材料與方法

　　3.1實(shí)驗(yàn)材料

　　供試茅蒼術(shù)：本實(shí)驗(yàn)于2020年月20日將收集的茅蒼術(shù)種苗來(lái)自江蘇茅山地區(qū)種植于南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園人工氣候室中，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與開(kāi)發(fā)教研室谷巍教授鑒定為菊科植物茅蒼術(shù)Atractylodeslancea(Thunb.)DC.的根莖。

　　對(duì)藥效成分含量進(jìn)行測(cè)定。對(duì)照品溶液的制備：精密稱取蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮和β桉葉醇的對(duì)照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.149、0.150、0.150mg/mL的混合對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備：精密稱取不同組別茅蒼術(shù)根莖粉末2.00，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞稱定質(zhì)量，超聲0min，放冷，加甲醇補(bǔ)足，搖勻?yàn)V過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.45μm微孔濾膜后得供試品溶液。

　　色譜條件：色譜柱：AgilentHCC18Analytical色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)，流動(dòng)相：乙腈0.1%甲酸水溶液，采取梯度洗脫：0~5min，A5%;5~6.25min，A10%~14%;6.25~26.25min，A14%~30%;26.25~32.5min，A30%~52%;32.5~42.5min，A52%~60%;42.5~73.75min，60%~75%;73.75~80min，A75%~80%;80~92.5min，A80%~10%，檢測(cè)波長(zhǎng)：蒼術(shù)素340nm;蒼術(shù)酮220nm;β桉葉醇203nm，流速0.8mL/min，柱溫30°C，乙腈、甲酸均為色譜純。

　　樣品測(cè)定：取對(duì)照品溶液適量，測(cè)定對(duì)照品蒼術(shù)素、蒼術(shù)酮、β桉葉醇的峰面積，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。取10mL供試品溶液注入高效液相色譜儀中檢測(cè)，并按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到相應(yīng)成分的含量。

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　　作者：裴凌峰谷宇琛谷巍1,2*張松保馬麗杰郭彥芳陳子勻張阿琴