摘要：生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)分子常常通過(guò)與其他蛋白質(zhì)分子發(fā)生相互作用來(lái)發(fā)揮其生物功能.因此，研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-proteininteraction，PPI)對(duì)于闡明蛋白質(zhì)分子的生物功能以及分子作用機(jī)理具有重要的意義.主要介紹基于生物物理和生物化學(xué)原理的檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)研究方法，并對(duì)發(fā)展趨勢(shì)做出展望.

　　關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用;生物物理方法;生物化學(xué)方法

　　蛋白質(zhì)是生命體的重要組成部分，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者和執(zhí)行者.人類基因組由20000￣30000個(gè)可編碼超過(guò)50萬(wàn)種不同蛋白質(zhì)的基因組成W.隨著人類基因組計(jì)劃的完成，旨在研究全基因組水平上所有蛋白質(zhì)的表達(dá)、結(jié)構(gòu)以及功能的蛋白質(zhì)組學(xué)已然成為后基因時(shí)代的研究熱點(diǎn).據(jù)估計(jì)，超過(guò)80%的蛋白質(zhì)并不是孤立存在，而是與其他蛋白質(zhì)通過(guò)相互作用形成穩(wěn)定或瞬時(shí)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)%蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-proteininteractions，PPIs)是分子生物學(xué)中最重要的現(xiàn)象之一，幾乎在所有的生命過(guò)程如細(xì)胞通訊、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答和基因轉(zhuǎn)錄中，都起著核心作用.通過(guò)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，可以探究蛋白質(zhì)在生命過(guò)程中的作用以及發(fā)揮功能的機(jī)制，更好地理解生命過(guò)程.

　　因此，對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究，已成為生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一W.蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是生物分子網(wǎng)絡(luò)中的基本組成元件，但是異常的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用很有可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展.因此，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的位點(diǎn)也成為新興的一類藥物IE點(diǎn)，例如G蛋白偶聯(lián)受體(Gprotein-coupledreceptors，GPCRs)、核激素受體、離子通道和酶等叭癌癥、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病等均有以靶向蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究，如細(xì)胞色素c-細(xì)胞色素c氧化酶[61、?0-1-?0-1^71、人卩￡1-116【-，1、MDM2P53@等.

　　因此，研究PPIs為開發(fā)治療疾病的新藥提供了更多機(jī)會(huì)隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的飛速發(fā)展，用于表征蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法相繼提出。比較傳統(tǒng)的技術(shù)方法有熒光偏振、核磁共振、酵母雙雜交和免疫共沉淀等.近年來(lái)新發(fā)展的方法包括生物膜干涉技術(shù)、微量熱泳動(dòng)(microscalethermophoresis，MST)技術(shù)、AlphaScreen和蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)分析技術(shù)等.表1中總結(jié)了9種基于生物物理和生物化學(xué)原理，并被廣泛用于表征蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及近年來(lái)發(fā)展的新檢測(cè)方法.

　　1基于生物物理原理的檢測(cè)方法

　　1.1表面等離子共振表面等離子共振(surfaceplasmonresonance，SPR)是一種基于物質(zhì)間相互作用所導(dǎo)致芯片表面質(zhì)量變化而產(chǎn)生的一種光學(xué)現(xiàn)象。目前，SPR生物傳感器已經(jīng)廣泛用于研究生物分子間的相互作用，可以對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)、無(wú)標(biāo)記檢測(cè).

　　SPR的原理 來(lái)衡量.傳感器表面與待研究蛋白質(zhì)之間的界面是傳感器系統(tǒng)的重要組成部分，一般購(gòu)買商業(yè)芯片，其中包括通過(guò)氨基偶聯(lián)的CM5芯片、用于固定His標(biāo)簽蛋白的NTA芯片和用于固定生物素化蛋白的SA芯片.與熒光或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)相比，SPR技術(shù)具有很多優(yōu)點(diǎn)：①測(cè)量基于折射率的變化，分析物不需要任何標(biāo)記，可直接檢測(cè);②測(cè)量可以實(shí)時(shí)進(jìn)行，研究人員能及時(shí)獲得動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和熱力學(xué)數(shù)據(jù);③作為一種多功能技術(shù)，能夠檢測(cè)各種分子量的蛋白質(zhì).

　　基于以上特點(diǎn)，SPR已成為研究生物分子間相互作用的有力工具#1.以MDM2-P53的相互作用為例，Wu等采用雙通道SPR傳感器測(cè)定在肉瘤組織提取的游離態(tài)和與P53結(jié)合的MDM2的水平，為了獲得更高的靈敏度和特異性，使用MDM2特異單克隆抗體(2A10)識(shí)別游離態(tài)和與p53結(jié)合的MDM2，發(fā)現(xiàn)由肉瘤組織提取的游離態(tài)和總MDM2(游離和結(jié)合形式組合)蛋白質(zhì)的濃度比正常組織提取的高，并且與P53結(jié)合的MDM2蛋白質(zhì)僅占總MDM2濃度的一小部分.

　　但是，SPR技術(shù)的缺點(diǎn)是難以區(qū)分實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的非特異性吸附，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響.傳統(tǒng)的SPR技術(shù)限于低通量研究，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)SPR生物傳感器僅在單個(gè)傳感器芯片上包含3￣4個(gè)流動(dòng)池.如今隨著技術(shù)的革新，表面等離子共振成像(surfaceplasmonresonanceimaging，SPRI)正在向高通量篩選(high-throughputscreening，HTS)發(fā)展.結(jié)合蛋白質(zhì)陣列技術(shù)和電荷親合器件(charge-coupleddevice，CCD)相機(jī)，并根據(jù)反射光的強(qiáng)度制作圖像，SPRI已經(jīng)發(fā)展到能同時(shí)處理成千上萬(wàn)個(gè)樣本[1Q，13].

　　1.2生物

　　膜干涉生物膜干涉(biolayerinterferometry，BLI)是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種基于光干涉量度法的檢測(cè)技術(shù)，可用于實(shí)時(shí)、快速、以非標(biāo)記方式分析生物分子之間的相互作用.BLI技術(shù) 將相互作用的生物分子之一通過(guò)氨基偶聯(lián)、生物素/鏈霉親和素、組氨酸標(biāo)簽/鎳離子螯合劑等方式固定于光纖制成的生物傳感器末端，形成生物膜層.當(dāng)一束可見光垂直入射生物膜層時(shí)，光在生物膜層的兩個(gè)界面反射后形成一束能被光譜儀檢測(cè)到的干涉光譜.當(dāng)固定分子與溶液中的分析物發(fā)生相互作用時(shí)，生物膜層厚度發(fā)生變化，通過(guò)檢測(cè)干涉現(xiàn)象的相位移動(dòng)，從而能夠分析結(jié)合到傳感器上的分子數(shù)量的變化I14-15].

　　BLI技術(shù)的應(yīng)用十分廣泛，可以檢測(cè)生物分子之間是否存在特異性結(jié)合.研究人員已將BLI技術(shù)廣泛用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究，如Pogoutse等M利用BLI技術(shù)測(cè)定兩組蛋白質(zhì)相互作用對(duì)Mms2/Ubcl3、鐵轉(zhuǎn)蛋白/TbpB間的結(jié)合常數(shù).該工作采用了鏈霉親和素固定的方式，目標(biāo)蛋白在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)生物素酰化過(guò)程，隨后以細(xì)胞裂解液取代純化的蛋白，通過(guò)BLI測(cè)得結(jié)合常數(shù)，既經(jīng)濟(jì)又省時(shí).

　　BLI技術(shù)具備實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、非標(biāo)記、高通量、快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè)親和力為1(T1Q￣104mol/L的相互作用，并且可提供結(jié)合的親和力ifD值及動(dòng)力學(xué)信息.相比表面等離子共振的微流控系統(tǒng)，BLI技術(shù)侵入即讀的檢測(cè)手法更為簡(jiǎn)便，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受樣品折射率影響，但是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要注意分析物是否與生物膜層存在非特異結(jié)合.另外，樣品緩沖液中所包含的部分去垢劑可能形成非均勻膠束，從而引起生物膜層非均勻性厚度變化，對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響[15]+

　　1.3微量

　　熱泳動(dòng)MST技術(shù)可以檢測(cè)分子在微觀溫度梯度場(chǎng)中的定向運(yùn)動(dòng)，因此也被稱之為熱泳動(dòng).定向運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象對(duì)由結(jié)合引起的分子大小、電荷、構(gòu)象或水化層的細(xì)微變化十分敏感，因而可以用來(lái)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用MST技術(shù)示意.

　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)相互作用的蛋白質(zhì)分子其中之一進(jìn)行熒光標(biāo)記，以溶液形式均勻分布于毛細(xì)管中.隨后，毛細(xì)管在紅外激光照射下形成局部溫度梯度，標(biāo)記分子因熱泳動(dòng)作用力而遠(yuǎn)離加熱區(qū)域，經(jīng)歷溫度躍遷(T-jump)后達(dá)到穩(wěn)定態(tài).在關(guān)閉激光后，標(biāo)記分子經(jīng)歷逆向溫度躍遷和反向擴(kuò)散后，恢復(fù)到均勻分布的狀態(tài)[18_2Q1.

　　上述這一過(guò)程會(huì)受到由結(jié)合引起的分子大小、電荷或水化層變化的影響，因而通過(guò)逐步滴定與標(biāo)記分子相互作用的蛋白質(zhì)，MST技術(shù)可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的解離常數(shù)[21_221MST技術(shù)可以很容易地測(cè)量蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，目前越來(lái)越多地應(yīng)用于與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用的研究中，從而揭示疾病發(fā)生的分子機(jī)制.

　　例如，纖毛結(jié)構(gòu)或者長(zhǎng)度的失調(diào)會(huì)引發(fā)疾病.纖毛的前體微管蛋白(tubulin)在纖毛內(nèi)運(yùn)輸與兩個(gè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)IFT74和IFT81有關(guān).Bhogaraju等網(wǎng)利用MST技術(shù)研究人類重組IFT81、IFT74與牛的ap-tubulin之間的偶聯(lián)特征，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IFT74/81復(fù)合物比單獨(dú)IFT81與tubulin的結(jié)合力大大增強(qiáng)，證明了與tubulin相偶聯(lián)的模塊是由IFT74/81復(fù)合物組成，而不是單獨(dú)的IFT81.

　　MST技術(shù)相比與其他體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)在于：①樣品無(wú)需固定處理;②樣品用量少，可對(duì)|iL級(jí)的溶液進(jìn)行檢測(cè);③對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量沒(méi)有限制;④可以進(jìn)行快速檢測(cè)，結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)可在10min內(nèi)完成測(cè)定;⑤可以測(cè)定pmol/L級(jí)的親和活性.此外，MST技術(shù)可以對(duì)復(fù)雜的生物體系如細(xì)胞裂解液、血漿等進(jìn)行測(cè)定[241+通常，MST技術(shù)需要熒光團(tuán)標(biāo)記蛋白質(zhì)分子.

　　2基于生物化學(xué)原理的檢測(cè)方法

　　2.1熒光共振能量轉(zhuǎn)移螢光費(fèi)振能慧轉(zhuǎn)移(fiuOTes御wreson陽(yáng)wenergytra取fer，遍指熒光供體在受到激發(fā)光激發(fā)后不發(fā)射出光予而將激發(fā)的能纛轉(zhuǎn)移到熒光受體上的現(xiàn)象(見_2(&))!夠.在對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相S作用的研究中，分子MFHE1T僅在熒光供體和受體相距非常近即形成復(fù)合物時(shí)發(fā)1喪.

　　因此，要產(chǎn)生FRET現(xiàn)象#要滿足3個(gè)條件：①供體發(fā)射光譜與受體激發(fā)光譜有重疊;@熒光供體和受體之間的距離在10nmoI/L范圍內(nèi);@H共體與受體之間迀移偶極子的方向平行^目前，廣泛用子供體與受體標(biāo)記的熒光染料來(lái)自于録色熒光選白(gremifluoreseeBtpmfeiii，GFF)的突靜體包播青色貴光：蛋自-脅色養(yǎng)光蛋：自柄fluorescentprot#n，jr沾ftuor傲centprotein，網(wǎng)、藍(lán)色獎(jiǎng)光蛋白-Gl?'P(bh^fluoreseeiitprotein-GPP，BrP-GEPJ?，CyPet-YpetW%Sffij^iriK〇M，OfPP-YFP。

　　隨著對(duì)FRET方法的優(yōu)化，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于體外測(cè)定結(jié)合活性并篩選氧歲質(zhì)-蛋白質(zhì)相II作用抑制劑蛋：白被小1纖泛素樣修飾物(flliallubi職itin-Bketiodi細(xì)r，SIJ域O)修憤鳥：真核坐物界的蘺粟修飾：途輕.SUMO可以組裝成寨合鏈，與食賣兩個(gè)SCMO相瓦作用：基■(SUMO-城_流通motif，SIM)：的受體蛋白，質(zhì)粗結(jié)氣從而對(duì)愛體蛋：：白貨：進(jìn)行修飾.Kost等設(shè)計(jì)了一種FRET傳感器，用于測(cè)定SUMO線處=聚體與包含SIM蛋白質(zhì)的結(jié)合，利用%來(lái)酰亞胺和銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將合成受體和供體的染料偶聯(lián)到SUMO亞基上，在多個(gè)進(jìn)M配體存棚情況下監(jiān)測(cè)PftlT變化.因此;開發(fā)PIET傳感器對(duì)于研究SCIMO-SIM：的相S作用具有￥常重要的價(jià)值.

　　3結(jié)束語(yǔ)

　　近年來(lái)表征蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的新技術(shù)、新方法不斷涌現(xiàn)，并向高靈敏度、高通量的方向發(fā)展.根據(jù)研究目標(biāo)的不同以及蛋白質(zhì)自身的特點(diǎn)，選擇合理的檢測(cè)方法十分重要.若要定性表征蛋白質(zhì)分子間是否存在相互作用，可以選擇傳統(tǒng)的拉下法、TAP、Co-IP等方法進(jìn)行檢測(cè);若要定量測(cè)量蛋白質(zhì)分子間的相互作用，可以選擇MST，SPR，PLI等方法進(jìn)行檢測(cè);若要進(jìn)行高通量的研究，可以選擇FRET，AlphaScreen，PCA等方法進(jìn)行檢測(cè).所有方法都有其自身的局限性，可能在檢測(cè)中出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果.

　　生物方向評(píng)職知識(shí)：蛋白質(zhì)工程論文發(fā)表指導(dǎo)

　　因此，應(yīng)該使用基于不同原理的技術(shù)方法相互驗(yàn)證，以獲得更為可靠的結(jié)果.同時(shí)，不同技術(shù)方法的聯(lián)用可彌補(bǔ)單種技術(shù)的不足.例如，借助質(zhì)譜的高靈敏度、高通量的優(yōu)勢(shì)，親和層析可以與質(zhì)譜(massspectroscopy，MS)聯(lián)用(即AP-MS)鑒定與目標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)，以獲得更完整的信息.隨著技術(shù)方法的持續(xù)進(jìn)步，在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域?qū)��?huì)更廣泛地應(yīng)用上述技術(shù).預(yù)計(jì)檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)將向高通量方向發(fā)展，并將會(huì)產(chǎn)生大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，因此需要發(fā)展更強(qiáng)大的生物信息處理工具將原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成有用的信息.

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　　作者：孔文娜，周宓2，林海霞王任小2