引言

　　華南地區位于我國南部，由山地、丘陵和平原構成，土壤富含植物生長所需的各種有機質;該地區屬于熱帶和亞熱帶季風氣候，全年高溫多雨，冬季溫暖，夏季漫長;適宜的溫度和充足的水分為豆科植物創造了良好的生長條件，間接導致喜食豆科植物的纓翅目害蟲為害日益嚴重，其中普通大薊馬 Megalurothrips usitatus 在海南省豇豆 Vigna unguiculata 上的為害尤為嚴重。目前，化學防治仍是防控的主要手段，在長期化學藥劑的高壓選擇下，海南省普通大薊馬已對多種新型藥劑產生不同程度抗性，因此，研發綠色環保的防控技術迫在眉睫。

　　復眼作為昆蟲最主要的視覺器官，在昆蟲覓食、求偶、產卵、越冬、遷徙和躲避天敵等視覺行為中起著重要作用。昆蟲復眼分為重疊像眼和并列像眼，夜出型昆蟲一般屬于重疊像眼，日出型昆蟲一般屬于并列像眼。復眼由許多小眼組成，小眼數量是影響昆蟲視覺能力的主要因素。目前僅對一些重大發生的害蟲和天敵昆蟲復眼形態結構特征進行了初步研究，而關于普通大薊馬復眼結構的研究較少。光感受器是視覺系統中的關鍵組成部分，根據昆蟲光感受器的光譜吸收最大值，光感受器可分為紫外敏感視蛋白、藍光敏感視蛋白和長波敏感視蛋白。最新研究發現，普通大薊馬中存在 4 種視蛋白。因此，了解普通大薊馬復眼形態結構，探究其視蛋白基因功能以及視蛋白對趨光行為潛在的調控機制對于防控該害蟲具有重要意義。

　　昆蟲對光具有趨避性，多數昆蟲對光表現為趨性，尤其是對紫外光、藍光和綠光。關于薊馬光譜敏感性的研究也很多，但已有研究未涉及普通大薊馬最敏感的紫外光區，而普通大薊馬是否對紫外光表現出特定的偏好性以及紫外光是否會影響普通大薊馬對特定波長光的偏好性均尚不清楚。

　　為明確普通大薊馬的光譜敏感性及其視蛋白基因的潛在行為調控機制，通過掃描電鏡觀察普通大薊馬雌、雄成蟲復眼的外部形態特征，采用自制行為測定裝置測定普通大薊馬在晝夜節律、單一光源和多種光源下的趨光性，采用實時熒光定量 PCR 技術分析 4 個視蛋白基因在普通大薊馬成蟲不同組織及 UV-A 不同處理時間后的表達量變化，以期為防控普通大薊馬提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　供試蟲源：2024 年 5—6 月自海南省五指山市毛陽鎮豇豆地采集普通大薊馬成蟲(雌雄比例約為 3∶1 或更高)帶回實驗室，于溫度(26±1)℃、相對濕度(70±5)%、光周期 14 L∶10 D 的實驗室內飼養，用洗凈的新鮮豇豆飼喂，繁殖 1 代后取健康活躍的雌、雄成蟲供試。新鮮豇豆品種為南豇 1 號，購于海南省三亞市南濱農貿市場。

　　試劑和儀器：TRIzol 試劑，美國賽默飛世爾科技公司;PrimeScript™Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，日本 TaKaRa 公司;ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒，南京諾唯贊生物科技股份有限公司;其余試劑均為國產分析純。SZ61 體視顯微鏡，日本 Olympus 公司;K850 臨界點干燥儀，英國 Quorum 公司;D II-29030 噴金儀，日本 JEOL 公司;HITACHI SU8100 型掃描電鏡，日本 HITACHI 公司;AriaMx 實時熒光 PCR 儀，美國 Agilent 公司;Micro Drop 紫外分光光度計，美國 BIO-DL Corporation 公司;功率均為 3 W 的 UV-A(波長 365 nm)、藍光(波長 460 nm)、綠光(波長 520 nm)和白光(色溫 6500 K)的 LED 單色光源，中山市古鎮鎮優威固照明電器廠;暗箱為正方體結構，邊長 30 cm，板寬 10 mm，底部鏤空，由黑色聚苯乙烯泡沫板組成，能防止其他光源干擾;亞克力材料，惠州市瑞峰亞克力制品有限公司。

　　行為測定裝置：自制。由透明與不透明亞克力板制成，亞克力板厚度均為 6 mm。裝置自上至下由趨光室、反應室、接蟲器、光源和底板 5 個部分組成。趨光室為五棱柱結構，反應室為長方體，接蟲器為圓柱體，底板為透明亞克力板。反應室與趨光室在鏤空處對齊連接，4 個面共形成 4 個趨光室，接蟲器位于反應室內部中央，底板位于行為反應裝置最下部，光源置于每個趨光室后方，光線正好能透射到趨光室。

　　1.2 方法

　　1.2.1 普通大薊馬復眼結構的掃描電鏡觀察

　　取健康活躍的普通大薊馬雌、雄成蟲各 8~10 頭放到 2.5% 戊二醛溶液中預冷，4℃避光固定 24 h;用 pH 為 7.2 的 0.1 mol/L PBS 緩沖液漂洗固定樣品 3 次，每次 15 min;將樣品依次置于不同濃度乙醇溶液中脫水;再置于 100% 叔丁醇溶液置換 30 min;將樣品置于干燥儀中干燥，用導電膠帶將干燥樣品粘在載物臺上，擠壓吸液球吹去未粘牢固的樣品，將樣品放入噴金儀中噴金使樣品表面形成導電膜，即獲得掃描電鏡樣品。將制備好的普通大薊馬雌、雄成蟲樣品置于掃描電鏡下觀察其復眼結構，雌、雄成蟲各觀察 2~3 頭。

　　1.2.2 普通大薊馬對不同單色光源的趨性測定

　　分別于白天 08:00—17:00 和夜間 21:00—05:00 在室內黑暗條件下測定普通大薊馬成蟲對 UV-A、藍光、綠光和白光 4 種單色 LED 光源的選擇行為。關閉室內無關干擾光源，在自制裝置外部裝暗箱。用吸蟲器將普通大薊馬成蟲接入到行為測定裝置的接蟲器內，將接蟲器置于底板中央，將組合好的裝置主體置于底板上，確保接蟲器位于反應室中心。安裝單色光源，每次安裝 1 種單色光源，將單色光源置于趨光室側面后方。外部安裝暗箱，開啟光源。每種單色光源分別連續處理 3、5、10、20、40 和 60 min，記錄每種單色光源每個時間段試蟲進入趨光室的數量。每種單色光源設 5 組生物學重復，每組 30 只試蟲，每組試蟲試驗結束后，用酒精擦拭裝置，計算趨光率，趨光率 = 反應蟲數 / 接入蟲數 ×100%。

　　1.2.3 普通大薊馬對多種不同光源的趨性測定

　　在 08:00—17:00 于室內黑暗環境下測定普通大薊馬成蟲對多種不同光源的趨性。當測定對 2 種單色光源的趨性時，將每次安裝 1 種光源設置為安裝 2 種單色光源，分別為 UV-A 和藍光、UV-A 和綠光及 UV-A 和白光，測定時 2 種單色光源夾角為 180°，每組處理 20 min，其他方法同 1.2.2;當測定對 3 種單色光源的趨性時，每次安裝 3 種單色光源，分別為 UV-A、藍光和白光及 UV-A、綠光和藍光，測定時 3 種單色光源擺放順序隨意，但位置呈 T 型，其他方法同 1.2.2;當測定對 4 種單色光源的趨性時，每次安裝 4 種單色光源，分別為 UV-A、綠光、藍光和白光，測定時 4 種單色光源擺放順序隨意，但位置呈十字型，其他方法同 1.2.2。

　　1.2.4 普通大薊馬各組織中視蛋白基因表達的測定

　　選取健康活躍的普通大薊馬成蟲約 2000 頭，每次取 100 頭試蟲置于載玻片上方，利用低溫凍暈試蟲。在體視顯微鏡下用昆蟲針將試蟲蟲體解剖為頭、胸和腹 3 個部分。最終每個部位樣品約 660 頭試蟲左右，每個樣品設 3 個生物學重復。將所得樣品分批次置于液氮中速凍，隨后轉移至 - 80℃冰箱保存。采用 Trizol 法提取不同組織樣品的總 RNA，按照 PrimeScript™Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明書合成 cDNA，置于 - 20℃冰箱保存。

　　參考相關研究設計視蛋白基因 Rh-1、Rh-2、Rh-3 和 UVRh-1 的引物，以 β actin 為內參基因，所有引物均委托公司合成。按照 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒說明書進行 RT-qPCR 擴增。20 μL RT-qPCR 反應體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL、正反向引物各 0.4 μL、cDNA 模版 2 μL、ddH₂O 7.2 μL。反應程序：95℃預變性 30 s;95℃變性 10 s，60℃退火 30 s，40 個循環;熔解曲線：95℃變性 15 s，60℃退火 60 s，95℃變性 15 s。每個樣品設置 3 個重復。根據 2-ΔΔCt 法計算目的基因的相對表達量。

　　1.2.5 UV-A 對普通大薊馬視蛋白基因表達的影響

　　選取健康活躍的普通大薊馬成蟲 50 頭，置于石英玻璃管內，管內提前放豇豆供試蟲取食，隨即置于室內暗箱黑暗處理 12 h，除對照外，將試蟲轉移至另一個相同暗箱中，暗箱內安置 UV-A 單色光源，對試蟲分別脅迫處理 3、5、10、20、40 和 60 min，每個處理 50 頭試蟲，重復 3 次，將處理后試蟲置于液氮中速凍，隨后轉移至 - 80℃冰箱中保存。按照 1.2.4 方法提取各處理樣品的總 RNA，合成 cDNA 及測定 4 個視蛋白基因的相對表達量。

　　1.3 數據分析

　　利用 SPSS 20.0 軟件對試驗數據進行統計分析，兩者之間采用 t 檢驗法進行差異顯著性檢驗，三者及以上采用 Tukey 法進行差異顯著性檢驗。

　　2 結果與分析

　　2.1 普通大薊馬復眼外部形態特征

　　普通大薊馬雌、雄成蟲的復眼位于蟲體觸角兩側、頭部兩端;復眼呈不規則腎形，在蟲體正面、兩側面、腹面和背面均有分布;雌、雄成蟲復眼單側約有 70 個小眼，小眼向外凸出，近似呈圓形，直徑大小不一，排列疏松且表面光滑，各小眼之間著生數量不一的感覺毛;在成蟲復眼邊緣有由多個小眼組成的背部邊緣區域;3 個背單眼位于蟲體背面且外緣有單眼鬃著生，其中 2 個對稱背單眼靠近蟲體胸部，另一個背單眼遠離胸部靠近觸角。

　　2.2 普通大薊馬對單色光源的趨性

　　2.2.1 晝夜條件下對不同單色光源的趨性

　　隨著處理時間的增加，普通大薊馬成蟲對同種光源的趨光率總體呈上升趨勢。在白天 08:00—17:00，普通大薊馬成蟲對 UV-A 的趨光率始終最高，除處理 40 min 時與對白光的趨光率無顯著差異外，其他均與對白光、藍光和綠光的趨光率差異顯著。在夜間 21:00—05:00，除處理 5 min 時普通大薊馬成蟲對 UV-A 的趨光率與對白光的趨光率和對藍光的趨光率差異顯著外，其他處理之間均差異不顯著。

　　2.2.2 晝夜節律下對同一單色光源的趨性

　　白天白光處理不同時間后普通大薊馬的趨光率均顯著高于黑夜白光處理后普通大薊馬的趨光率。白天 UV-A 處理不同時間后普通大薊馬的趨光率均顯著高于黑夜 UV-A 處理后普通大薊馬的趨光率。盡管白天藍光處理 3 min 和 5 min 后普通大薊馬的趨光率與黑夜藍光處理后普通大薊馬的趨光率差異顯著，但其他處理的趨光率之間均差異不顯著。白天綠光處理不同時間后普通大薊馬的趨光率與黑夜綠光處理后普通大薊馬的趨光率之間差異不顯著。

　　2.3 普通大薊馬對多種不同光源的趨性

　　處理 20 min 后，普通大薊馬對 UV-A 的趨光率極顯著高于對白光、藍光和綠光的趨光率。在不同組合的單色光源中，普通大薊馬對 UV-A 的趨光率均顯著高于對其他光源的趨光率。

　　2.4 普通大薊馬視蛋白基因的表達規律

　　2.4.1 在各組織中視蛋白基因的表達

　　普通大薊馬視蛋白基因 Rh-1、Rh-2、Rh-3 和 UVRh-1 的相對表達量在不同組織部位中存在顯著差異，其中在頭部中的相對表達量均遠遠高于在胸部和腹部的相對表達量，且視蛋白基因在胸和腹中表現出低表達的現象。在頭部中，視蛋白基因 Rh-1 的相對表達量最高，其次為視蛋白基因 Rh-2 和 Rh-3，視蛋白基因 UVRh-1 的相對表達量最低。

　　2.4.2 UV-A 脅迫處理下視蛋白基因的表達

　　UV-A 脅迫處理不同時間后，普通大薊馬視蛋白基因 Rh-1 的相對表達量呈上升趨勢，部分處理時間較對照顯著上調;Rh-2 的相對表達量在部分處理時間較對照顯著上調;Rh-3 的相對表達量除個別處理時間顯著低于對照外，其他處理與對照無顯著差異;UVRh-1 相對表達量在部分處理時間較對照顯著降低或增加，其他處理與對照之間無顯著差異。

　　3 討論

　　復眼是昆蟲感受外界光線的主要器官，其結構特點反映了昆蟲為適應環境而演化的生存習性和行為方式。本研究結果表明，普通大薊馬復眼呈不規則腎形，位于頭部兩側，占據了頭部大部分空間，從而提高了其視野范圍;雌、雄成蟲復眼單側大約各有 70 個小眼，且復眼外部形態特征上無明顯差異。與其他薊馬研究結果的差異可能與昆蟲種類、個體大小和拍攝角度不同有關。

　　昆蟲為了適應環境中的光線、溫度、濕度、食物供應、相互競爭和捕食等逐漸形成了一種復雜的晝夜節律行為模式，這種節律行為有助于它們更好地生存和繁殖。本試驗研究發現，普通大薊馬對晝夜有感知，其趨光行為在白天和夜間存在差異，推測普通大薊馬復眼類型為并列像眼。

　　趨光昆蟲主要對不同波長的光發生趨光反應。本研究結果顯示，在不同光源組合中，普通大薊馬對 UV-A 的趨光率最明顯，與其他薊馬對紫外光區表現出強烈吸引力的研究結果基本一致。

　　視蛋白是一類關鍵的光感受蛋白，主要在復眼等光感受器組織中高表達。本研究結果顯示，普通大薊馬視蛋白基因在頭部高表達，存在組織特異性，UV-A 照射能誘導視蛋白基因表達，但關于視蛋白基因的生理功能及其與相關蛋白的協同作用還需進一步驗證。

　　本研究明確了晝夜節律、光源和視蛋白表達規律等因素對普通大薊馬的影響及相互關系;但本研究僅在室內比較了 4 種單色光源，下一步將增加光源數量，并在田間開展試驗。

寧恒亨;王朝政;蒿文勇;金海峰;李 芬;吳少英,海南大學三亞南繁研究院;海南大學熱帶農林學院;海口海關技術中心;陽谷縣農業農村局,202406