引言

　　近年來，全球感染性疾病仍是人類健康的主要威脅之一。在治療感染性疾病時，準確和及時的病原學診斷至關(guān)重要。然而，傳統(tǒng)的病原體檢測方法存在各種局限性，如培養(yǎng)耗時長、陽性檢出率低;免疫學方法準確度有待提升;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測覆蓋病原體有限;Sanger 測序技術(shù)通量小、速度慢、成本高。

　　高通量測序技術(shù)為病原體檢測提供了新可能，包括宏基因組二代測序(mNGS)和靶向高通量測序(tNGS)。mNGS 在感染性疾病病原體快速診斷方面有優(yōu)勢，但高成本、易受宿主核酸干擾等因素阻礙其臨床廣泛應(yīng)用。tNGS 基于多重 PCR 擴增或探針靶向捕獲，能選擇性擴增或富集目標片段，同時檢測多種病原體，成為高效、經(jīng)濟且準確的病原體檢測工具。目前，tNGS 在感染性疾病病原體檢測中潛力較大，為規(guī)范其臨床應(yīng)用，制訂本共識，采用 2011 版牛津大學循證醫(yī)學證據(jù)分級與推薦意見強度分級方法，形成 24 條建議。

　　1.臨床適應(yīng)證

　　建議 1：對于疑似下呼吸道感染的非重癥患者，滿足傳統(tǒng)微生物檢測未明確病原體、經(jīng)驗性抗感染治療 2 - 3 d 效果不佳、屬于高危人群(兒童、老年人、孕婦、肥胖和存在基礎(chǔ)疾病等)這三個條件之一，建議進行 tNGS 檢測。下呼吸道感染病原體類型復雜，tNGS 在檢測病原體、識別非典型病原體和混合感染方面優(yōu)勢顯著，且在檢測常見病原體時與 mNGS 相當，但檢測效率和成本效益更高，對下呼吸道感染的抗感染治療有指導價值。此外，tNGS 在兒童肺炎支原體感染診斷中準確性良好，還可檢測耐藥基因突變位點。

　　建議 2：對于疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的非重癥患者，若經(jīng)驗性抗感染治療 2 - 3 d 效果不佳、傳統(tǒng)微生物檢測結(jié)果陰性(腦膜炎、腦脊髓膜炎、腦炎和疑似顱內(nèi)感染占位性病變)或為新生兒，建議進行 tNGS 檢測。傳統(tǒng)腦脊液培養(yǎng)陽性率低，tNGS 在檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染病原體方面準確率、敏感度和特異度更高，診斷時間和成本效益也有優(yōu)勢。

　　建議 3：對于疑似血流感染(BSI)的非重癥患者，當傳統(tǒng)微生物檢測結(jié)果陰性、經(jīng)驗性抗感染治療 2 - 3 d 效果不佳，或?qū)儆趦和⒃袐D、老年人以及存在基礎(chǔ)疾病的高危人群，建議進行 tNGS 檢測。BSI 是危及生命的全身性感染疾病，tNGS 有望快速準確識別病原體，幫助臨床診斷和治療。研究顯示，血液 tNGS 對 BSI 診斷敏感度更高，檢測周轉(zhuǎn)時間更快，部分患者根據(jù)檢測結(jié)果調(diào)整治療后病情改善。

　　建議 4：對于疑似泌尿系統(tǒng)、脊柱關(guān)節(jié)感染的患者，若傳統(tǒng)微生物檢測結(jié)果陰性、經(jīng)驗性抗感染治療 2 - 3 d 效果不佳，建議進行 tNGS 檢測。tNGS 在關(guān)節(jié)假體感染診斷中的敏感度和特異度與培養(yǎng)和 mNGS 相當，且在成本和檢測周轉(zhuǎn)時間方面更優(yōu)。tNGS 檢測尿路感染病原體具有快速、靈敏和全面的優(yōu)勢，可作為傳統(tǒng)檢測方法的有效補充，在復雜和混合感染的尿路感染性疾病中，能識別多種微生物并提供更詳細診斷信息。

　　建議 5：對于結(jié)核分枝桿菌等耐藥基因與表型一致性較高的物種，若需進行耐藥檢測，建議采用 tNGS 檢測方法。tNGS 針對結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的預測是判斷其耐藥性的重要依據(jù)，與傳統(tǒng)方法相比，能更快速識別結(jié)核分枝桿菌的譜系和耐藥性，對結(jié)核分枝桿菌的檢出率較高，且與全基因組測序(WGS)檢測結(jié)果高度一致，可為耐藥結(jié)核病治療提供臨床信息。

　　建議 6：對于傳統(tǒng)方法檢測病原體尚未明確且病因不明的危重癥患者、病因不明的免疫功能缺陷或抑制患者、社區(qū)聚集疑似新發(fā)病原體暴發(fā)流行的病例，優(yōu)先考慮 mNGS 送檢。免疫功能抑制患者感染病原體復雜，mNGS 覆蓋病原體更廣泛、臨床符合率高，能發(fā)現(xiàn)更多感染情況。在社區(qū)性感染暴發(fā)時，mNGS 病原體覆蓋更廣，可幫助盡快明確病原體，采取防控措施。

　　建議 7：tNGS 檢測結(jié)果判讀需結(jié)合患者病情、標本類型和實驗室檢測結(jié)果，必要時結(jié)合文獻資料綜合判讀;對于病情嚴重且病因不明的患者，建議感染科、病原微生物團隊及相關(guān)臨床科室多學科會診。多標本檢測可為致病菌判斷提供更多參考信息，多學科會診有助于確定感染病因，分析微生物群落關(guān)系。

　　2. tNGS 的實驗流程建議

　　建議 8：盡量在使用抗菌藥物治療前，采集臨床疑似感染患者的樣本，并且優(yōu)先選擇采集感染部位的樣本。實驗室需對來自疑似感染部位的各種類型樣本建立完整的前處理流程，充分保障生物安全性。如懷疑下呼吸道感染，盡可能采集支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行檢測;不同樣本采集有不同要求，采集后需及時送檢，實驗室收到樣本后要記錄信息并注意生物安全和樣本預處理。

　　建議 9：實驗室應(yīng)針對不同類型樣本、特殊病原體(如胞內(nèi)特殊病原體或真菌等厚壁病原體)等建立相應(yīng)的核酸提取流程，并設(shè)立陰性對照和陽性對照。核酸質(zhì)量是高通量測序成功的關(guān)鍵，需根據(jù)病原體類型選擇合適樣本處理和核酸提取方法，常用方法有柱提法和磁珠法，還可結(jié)合其他裂解方法提高樣本裂解效率，同時要對核酸進行純度和濃度評估，注意防止 RNA 降解。

　　建議 10：基于探針捕獲技術(shù)和多重 PCR 技術(shù)的 tNGS 各有優(yōu)缺點，實驗室需要根據(jù)具體的臨床需求、適用場景、樣本類型、預期的病原體種類和數(shù)量、實驗室的設(shè)備和技術(shù)水平等因素進行綜合考慮選擇。基于探針捕獲技術(shù)的 tNGS 適合已知病原體檢測，尤其是苛養(yǎng)和低載量病原體;基于多重 PCR 技術(shù)的 tNGS 實驗步驟簡單快捷，但穩(wěn)定性相對較低。

　　建議 11：生物信息學分析中，應(yīng)對分析流程及時進行更新與優(yōu)化，對于病原體數(shù)據(jù)庫，應(yīng)選擇高質(zhì)量文獻報道及行業(yè)認可的公共數(shù)據(jù)庫，并結(jié)合實驗室自身情況進行參數(shù)調(diào)整，以確保準確報告致病病原體。生物信息學分析流程需經(jīng)過細致評估，包括對照組和患者數(shù)據(jù)集的分析比較，通過常規(guī)實驗室結(jié)果確認最終結(jié)果準確性，且要詳細記錄所使用的生物信息學方法。

　　3. 質(zhì)量控制

　　建議 12：實驗室應(yīng)通過合理的布局、環(huán)境潔凈度控制、單向工作流程、嚴格的去污染方案和對照的設(shè)置等降低污染風險，尤其采用專用操作空間，以最大程度減少氣溶膠污染。tNGS 檢測的最大挑戰(zhàn)是污染導致的假陽性，污染來源包括實驗室試劑、環(huán)境中的背景微生物和氣溶膠污染等，因此操作人員需訓練有素，樣品處理過程要格外小心，同時各實驗室應(yīng)采取去污染方案控制交叉污染。

　　建議 13：實驗室的核酸提取流程(手工法或者試劑盒法)應(yīng)經(jīng)過驗證;測序原始數(shù)據(jù)應(yīng)進行質(zhì)量控制，確保測序原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量。不同測序平臺產(chǎn)生不同讀長，實驗室應(yīng)根據(jù)平臺及樣本類型選擇合適試劑盒和檢測流程，對合成寡核苷酸材料的來源、質(zhì)量和數(shù)量進行質(zhì)控，數(shù)據(jù)與序列管理需要檢驗醫(yī)師、臨床醫(yī)師綜合團隊參與。

　　建議 14：建議下機數(shù)據(jù)中單樣本平均數(shù)據(jù)量≥1 M，識別正確率超過 99.9% 的堿基占比(Q30)≥85%。測序數(shù)據(jù)量關(guān)系到 tNGS 診斷的敏感度和特異度，較高數(shù)據(jù)量可提高低豐度病原體檢出率，減少假陽性和假陰性結(jié)果，提高診斷準確性。

　　建議 15：tNGS 技術(shù)中陽性閾值的設(shè)定對于確保檢測的敏感度、特異度和臨床意義至關(guān)重要，需基于實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析、臨床意義、病原體特性、樣本類型、測序平臺、生物信息學數(shù)據(jù)庫、質(zhì)控標準及相關(guān)標準或指南等，并保證結(jié)果的可重復性。各實驗室應(yīng)根據(jù)自身檢測流程，結(jié)合多種因素設(shè)定相應(yīng)陽性閾值，確保結(jié)果符合行業(yè)規(guī)范。

　　建議 16：建議對整個檢測和分析流程中的參考樣品(代表物種)的檢出限、精密度、準確性、穩(wěn)定性及重復性等進行確認。確認這些性能可確保實驗室檢測性能，通過使用陰性、陽性質(zhì)控和標準參考品，在不同時間點、不同操作人員和不同儀器上重復實驗完成，還應(yīng)進行方法比較研究，評估檢測流程中的偏差和干擾因素，比較 tNGS 結(jié)果與傳統(tǒng)微生物學方法和其他分子診斷技術(shù)的一致性。

　　建議 17：實現(xiàn) tNGS 醫(yī)療機構(gòu)本地化檢測能夠較好地進行實驗室管理與人才培養(yǎng)，提高對抗傳染病的應(yīng)急響應(yīng)能力。醫(yī)院內(nèi)部建立檢測平臺可提升技術(shù)和運營水平，滿足特定臨床需求，縮短樣本處理和結(jié)果報告時間，有助于控制傳染病傳播和指導臨床治療，但也面臨技術(shù)人員質(zhì)控意識、儀器設(shè)備校準等挑戰(zhàn)。

　　4. 報告解讀

　　建議 18：tNGS 結(jié)果的報告應(yīng)包含患者和送檢機構(gòu)的基本信息、詳細的 tNGS 檢測方法、檢測范圍、檢測結(jié)果及其解釋、質(zhì)量控制措施、專業(yè)的報告格式、結(jié)論和建議、報告解釋權(quán)和聯(lián)系方式，以及相關(guān)的參考文獻。報告內(nèi)容應(yīng)詳細準確，為臨床診斷提供全面信息。

　　建議 19：為確保 tNGS 檢測的準確性，可使用質(zhì)控品建立背景微生物數(shù)據(jù)庫和排除環(huán)境污染等情況。通過陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品進行質(zhì)控，陰性質(zhì)控品檢測結(jié)果應(yīng)為陰性，陽性質(zhì)控品應(yīng)正確檢出對應(yīng)病原體，否則實驗檢測結(jié)果無效。

　　建議 20：測序完成后，應(yīng)全面進行樣本和實驗流程的質(zhì)控，包括下機數(shù)據(jù)量、數(shù)據(jù)質(zhì)量、內(nèi)參、陰性及陽性質(zhì)控等。質(zhì)控合格后再進行分析，使用比對工具將過濾后的讀段與參考病原體數(shù)據(jù)庫比對，對檢出物種進行注釋。

　　建議 21：理論上標準化后的物種(種或型或亞型)SDSMRN 高于其對應(yīng)類別的陽性判斷閾值則視為檢出，同時考慮微生物自身特點及患者臨床實際情況。檢出病原微生物需綜合多種因素判斷，檢出序列數(shù)可能不足以反映病原體真實情況，應(yīng)結(jié)合臨床實際和其他檢測結(jié)果判斷是否為致病微生物。

　　建議 22：報告中某種 / 某些胞內(nèi)菌(如結(jié)核分枝桿菌)/ 厚壁菌(真菌，如曲霉等)檢出序列數(shù)不高時，需要結(jié)合患者臨床癥狀及其他檢測結(jié)果綜合判斷。低序列數(shù)可能是破壁技術(shù)問題導致 DNA 釋放不充分，因此需綜合多種檢測進行準確診斷。

　　建議 23：tNGS 結(jié)果判讀為陰性，應(yīng)該結(jié)合整體檢出情況綜合判斷，不能作為排除感染標準。tNGS 靶標有限，陰性結(jié)果也可能存在其他非靶標病原體感染，且檢測結(jié)果受多種因素影響，臨床醫(yī)師應(yīng)綜合考慮。

　　建議 24：采用 tNGS 進行耐藥基因 / 毒力因子鑒定時，需要明確耐藥 / 毒力基因型不等于表型，最終結(jié)果還應(yīng)結(jié)合實驗室檢測結(jié)果進行驗證。對于耐藥基因與表型一致性較高的物種，基因分型結(jié)果可作為用藥指導，但對于許多微生物，tNGS 檢測結(jié)果僅作參考，需結(jié)合實驗室結(jié)果和臨床實際情況判斷。

　　5. 總結(jié)與展望

　　tNGS 在病原體診斷中潛力巨大，可精準識別多種病原體，適用于復雜或混合感染，還能檢測病原體耐藥基因，推動精準醫(yī)學發(fā)展，但對于基因型與表型關(guān)系不明確的病原體，耐藥基因檢測與臨床表現(xiàn)可能不一致，需整合數(shù)據(jù)庫深入研究耐藥機制。隨著測序技術(shù)發(fā)展，靶向長讀長測序可提高拼接完整性和準確性，用于病原體識別和追蹤，但目前成本較高。總體而言，tNGS 成本逐漸降低，應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⒏鼜V泛，有望成為常規(guī)臨床診斷工具，在全球發(fā)揮重要作用，但檢測結(jié)果需結(jié)合傳統(tǒng)微生物學診斷技術(shù)及臨床綜合分析判讀。

盧洪洲,深圳市第三人民醫(yī)院;南方科技大學附屬第二醫(yī)院,202406