由開放性骨折、手術(shù)和慢性疾病等引起的感染性骨缺損?？蓪?dǎo)致肢體壞死、功能障礙，嚴(yán)重者甚至截肢，目前仍是臨床治療難題。當(dāng)病原菌侵入骨骼系統(tǒng)時(shí)會(huì)導(dǎo)致局部持續(xù)性炎癥反應(yīng)和骨組織的破壞，阻礙骨再生，進(jìn)而形成骨缺損。目前治療感染性骨缺損把控制感染放在首要目標(biāo)，傳統(tǒng)治療方法為徹底清創(chuàng)、抗生素浸漬的骨水泥填充后進(jìn)行自體骨移植，但常常會(huì)出現(xiàn)抗生素濃度不足、耐藥性產(chǎn)生等缺點(diǎn);此外，長期進(jìn)行抗生素治療還會(huì)產(chǎn)生腎毒性及胃腸道不良反應(yīng)。在骨重建方面，雖然自體骨移植是目前臨床治療的金標(biāo)準(zhǔn)，但也存在供體骨量有限及供區(qū)并發(fā)癥的缺點(diǎn)。因此，為了在抗感染和骨再生之間實(shí)現(xiàn)平衡，尋求在感染部位局部可控釋放抗生素并促進(jìn)骨修復(fù)的雙功能生物材料具有重要臨床意義。

　　近年來，生物材料在組織工程中的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注。其中，水凝膠作為一種具有良好生物相容性和可塑性的材料，被廣泛應(yīng)用于藥物遞送來治療感染性骨缺損。水凝膠的互連多孔結(jié)構(gòu)有利于藥物擴(kuò)散，水凝膠的親水性為局部組織提供了有利的微環(huán)境，并表現(xiàn)出與組織和細(xì)胞的良好親和力。透明質(zhì)酸是一種親水性聚合物，具有無免疫原性、優(yōu)異的生物相容性和抗蛋白質(zhì)吸附性等特點(diǎn)，作為水凝膠和藥物輸送系統(tǒng)的成分在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。透明質(zhì)酸具有多個(gè)反應(yīng)性端基，可為各種藥物和材料提供結(jié)合位點(diǎn)。氧化葡聚糖是一種生物可降解材料，由于可被人體組織代謝和降解而得到廣泛應(yīng)用。透明質(zhì)酸和氧化葡聚糖可以通過簡單混合的方法相互交聯(lián)形成具有穩(wěn)定性能的水凝膠，并且不需要額外的化學(xué)交聯(lián)劑，具有良好的生物相容性，并且形成的水凝膠能夠模擬細(xì)胞外基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的高黏附性。萬古霉素是一種三環(huán)糖肽抗生素，對(duì)成骨細(xì)胞分化沒有毒性作用，并且能夠有效殺死感染性骨缺損中最常見的病原體金黃色葡萄球菌，因此被廣泛認(rèn)為是治療感染性骨缺損的首選抗生素 。透明質(zhì)酸和氧化葡聚糖相結(jié)合的復(fù)合水凝膠，為感染性骨缺損局部遞送萬古霉素提供了一種優(yōu)良的載體 。

　　此次實(shí)驗(yàn)將萬古霉素負(fù)載于透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖復(fù)合水凝膠中構(gòu)建了一種用于治療感染性骨缺損的水凝膠藥物緩釋系統(tǒng)，擬通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該水凝膠對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、成骨分化的影響，通過體外抗菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該水凝膠對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制情況，并將該藥物遞送體系注射至家兔感染性骨缺損模型內(nèi)，研究其在感染微環(huán)境下的治療效果。

　　1材料和方法

　　1.1 設(shè)計(jì)

　　體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，組間比較進(jìn)行 t 檢驗(yàn)或單因素方差分析。

　　1.2 時(shí)間及地點(diǎn)

　　實(shí)驗(yàn)于 2022 年 8 月至 2024 年 2 月在西安交通大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室完成。

　　1.3 材料

　　1.3.1 細(xì)胞與菌種

　　兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞購自蘇州賽業(yè)公司;大腸桿菌(E.coli，ATCC25922)和金黃色葡萄球菌(S.aureus，ATCC25923)均購自上海市魯微科技有限公司。

　　1.3.2 主要試劑

　　低糖 DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購自 Gibco 公司;萬古霉素購自西格瑪奧爾德里奇(上海);青霉素鏈霉素雙抗和胰蛋白酶 - EDTA(0.05% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA)溶液購自 Sigma-Aldrich 公司;CCK-8、鈣黃綠素 - AM-PI 染色試劑盒、RIPA 裂解緩沖液、BCIP/NBT 堿性磷酸酶顯色試劑盒和堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒均購自碧云天有限公司(中國上海);PBS、DAPI 溶液、TRITC 類淀粉樣蛋白和 40g/L 多聚甲醛購自 Solarbio 公司(中國北京);兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和茜素紅染色劑購自 Cyagen 公司(美國圣克拉拉);FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit、ABScript Ⅱ RT Master Mix for qPCR with gDNA Remover 和 Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 購自 Abclonal Co.(中國武漢);氯化十六烷基吡啶溶液(索萊寶，北京);RUNX2 和骨鈣素抗體購自博奧森生物技術(shù)有限公司(北京);異硫氰酸熒光素(麥克斯瑪生物科技有限公司，中國)。

　　1.3.3 主要儀器

　　紫外可見分光光度計(jì)(Shimadzu Company，Japan);掃描電子顯微鏡(Zeiss Sigma 300);流變儀(Anton Paar);熒光顯微鏡(Olympus FV 1000);Micro-CT 掃描儀(比利時(shí)，孔蒂奇 SkyScan 1076 掃描儀)。

　　1.3.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　8 周齡雄性家兔 33 只，體質(zhì)量 2.5-3.0kg，購自西安市中心醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SYXK(陜)2021-005。2 只 1 周齡新西蘭乳兔購自西安市坊洲動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已獲得西安市中心醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：院醫(yī)倫 [2021] 52 號(hào))。

　　1.4 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.4.1 載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠的合成

　　將 50mg 透明質(zhì)酸溶于去離子水中，制備 500mg/mL 的透明質(zhì)酸溶液。將氧化葡聚糖溶于氫氧化鈉溶液(100mg/mL)中，制備最終質(zhì)量濃度為 20mg/mL 的氧化葡聚糖溶液。將透明質(zhì)酸溶液和氧化葡聚糖溶液以體積比 1∶1 混合，將溶液的最終 pH 值調(diào)節(jié)為 7.2，隨后將萬古霉素加入到混合溶液中，最終萬古霉素的質(zhì)量濃度為 10mg/mL。以同樣的方法制備不含有萬古霉素的透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠，作為對(duì)照組。

　　1.4.2 載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠的藥物釋放

　　將載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠與 PBS(pH=7.4)以 1∶4 的體積比一起注入離心管中，置于恒溫培養(yǎng)箱中振蕩(37℃、100r/min)。在預(yù)定好的間隔時(shí)間點(diǎn)，收集 1mL PBS，并加入等量全新的無菌 PBS。使用紫外可見分光光度計(jì)在 280nm 波長處測(cè)量收集 PBS 的吸光度值，計(jì)算藥物累計(jì)釋放率。

　　1.4.3 載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠的表征

　　將載萬古霉素的透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠在 - 80℃下冷凍 6h，然后在 - 70℃下凍干 48h，以確保水凝膠中的水分充分排出，對(duì)樣品進(jìn)行噴金濺射涂層處理，通過掃描電子顯微鏡觀察載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠的表面形態(tài)。使用流變儀測(cè)定水凝膠的流動(dòng)變形特性。在 25℃下將載萬古霉素的透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠涂抹到流變儀板上，然后以 0.5℃/min 的速度加熱，溫度范圍為 0-100℃，在恒定應(yīng)變(0.1%)和頻率(1Hz)條件下，使用流變儀測(cè)量水凝膠存儲(chǔ)模量(G′)和損耗模量(G′′)的變化。

　　1.4.4 載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠的生物相容性

　　兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：取新西蘭乳兔，脫頸處死后暴露四肢骨，用裝有 1mL 低糖 DMEM 培養(yǎng)基的注射器對(duì)四肢骨髓腔反復(fù)沖洗，直至骨髓腔沖洗液變清亮，收集骨髓清洗液至培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打骨髓清洗液以消除細(xì)胞團(tuán)，獲得細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸浮在含有體積分?jǐn)?shù) 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 - 鏈霉素的低糖 DMEM 培養(yǎng)基中，置于 37℃、體積分?jǐn)?shù) 5%

　　CO2培養(yǎng)箱中孵育。傳至第 3 代時(shí)用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞與水凝膠共培養(yǎng)：將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于 48 孔板中，細(xì)胞密度為

　　8×10孔，分 3 組處理：空白組不進(jìn)行任何處理，對(duì)照組加入 200μL 透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠，實(shí)驗(yàn)組加入 200μL 載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠，每組 3 復(fù)孔。

　　活死染色：培養(yǎng)第 1,3 天，去除培養(yǎng)基，將活 / 死染色液加入到孔板中，室溫避光條件下孵育 30min，去除染色液，用 PBS 沖洗 2 次以去除多余的染色液，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

　　細(xì)胞增殖檢測(cè)：培養(yǎng) 1,4,7d，每孔中加入 CCK-8 染色液，置于 37℃、體積分?jǐn)?shù) 5% CO2培養(yǎng)箱中避光孵育 3h，使用紫外可見分光光度計(jì)在 450nm 處測(cè)量吸光度值。

　　1.4.5 載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠的體外促成骨性能

　　堿性磷酸酶染色：將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種到 6 孔板中，細(xì)胞密度為 8×10 孔，在培養(yǎng) 24h 后觀察到 80% 以上的細(xì)胞貼壁，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分 3 組處理：空白組不進(jìn)行任何處理，對(duì)照組加入 1mL 透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠，實(shí)驗(yàn)組加入 1mL 載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠，每組 3 復(fù)孔。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 7d 后，40g/L 多聚甲醛固定細(xì)胞 30min，室溫下加入 BCIP/NBT 堿性磷酸酶顯色試避光孵育 1h，置于顯微鏡下觀察并拍照。同時(shí)，用 RIPA 裂解緩沖液充分裂解各組細(xì)胞，12 000×g 離心 1min，收集上清液于 96 孔板中，依次加入顯色底物和二乙醇胺緩沖液于 37℃孵育 30min，加入反應(yīng)終止液，使用紫外可見分光光度計(jì)在 405nm 波長處測(cè)量吸光度值。

　　茜素紅染色：將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種到 24 孔板中，細(xì)胞密度為 2×10 孔，在培養(yǎng) 24h 后觀察到 80% 以上的細(xì)胞貼壁，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分 3 組處理：空白組不進(jìn)行任何處理，對(duì)照組加入 0.2mL 透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠，實(shí)驗(yàn)組加入 0.2mL 載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠，每組 3 復(fù)孔。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 14d 后，用 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次，40g/L 多聚甲醛固定細(xì)胞 30min，每孔加入茜素紅染液孵育 1h，用 PBS 漂洗樣品 2 次以去除過量的染色液，置于顯微鏡觀察下觀察鈣結(jié)節(jié)數(shù)量。同時(shí)，使用 10% 氯化十六烷基吡啶溶液溶解所有鈣結(jié)節(jié)，使用紫外可見分光光度計(jì)在 540nm 處測(cè)量吸光度值。

　　RUNX2 免疫熒光染色：細(xì)胞接種與分組處理同茜素紅染色。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 14d 后，40g/L 多聚甲醛固定細(xì)胞 30min，用 PBS 潤洗 3 次;用 0.1% TritonX-100 透化細(xì)胞 15min，用體積分?jǐn)?shù) 10% 山羊血清封閉細(xì)胞 1h;加入 RUNX2 抗體(稀釋比 1∶200)4℃下孵育過夜，加入山羊抗兔二抗(稀釋比 1∶500)于 37℃下孵育 1h;加入 DAPI 染液對(duì)細(xì)胞核染色 5min，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照，使用 Image J 軟件統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)量。

　　RT-qPCR 檢測(cè)：細(xì)胞接種與分組處理同茜素紅染色。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng) 14d 后，使用快速提取法提取細(xì)胞總 RNA，對(duì) RNA 的純度進(jìn)行檢測(cè)。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，隨后使用 2×Fast SYBR Green Master Mix 在 LightCycler 480 上進(jìn)行 qPCR 擴(kuò)增，檢測(cè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 與骨鈣素 mNRA 表達(dá)。特異基因引物序列見表 1。以標(biāo)準(zhǔn)化 GAPDH 作為管家基因，使用

　　1.4.6 載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠的體外抗菌性能

　　將大腸桿菌(或金黃色葡萄球菌)放入 LB 培養(yǎng)基中，菌液濃度 1×10 CFU/mL，置于 37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱(振蕩頻率 120r/min)中孵育過夜，分 3 組處理：空白組不進(jìn)行任何處理，對(duì)照組加入 0.2mL 透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠，實(shí)驗(yàn)組加入 0.2mL 載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠，每組設(shè)置 3 個(gè)平行對(duì)照。培養(yǎng) 12,24,48h，吸取 100μL 細(xì)菌懸浮液到 96 孔培養(yǎng)板中，使用紫外可見分光光度計(jì)在 600nm 波長處檢測(cè)吸光度值，繪制細(xì)菌生長曲線。

　　1.4.7 載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

　　感染性骨缺損動(dòng)物模型的建立與分組干預(yù)：取 33 只家兔，腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉后暴露左前臂橈骨，在橈骨中段截取長度為 1.5cm 的骨缺損，然后將浸泡在金黃色葡萄球菌懸浮液

　　(1×107 CFU/mL)中的可吸收明膠海綿植入缺損部位以誘導(dǎo)感染，逐層縫合切口。術(shù)后不進(jìn)行抗生素治療。2 周后隨機(jī)挑取 3 只家兔，觀察創(chuàng)面是否有竇道形成并獲取橈骨標(biāo)本，進(jìn)行 Giemsa 染色和蘇木精 - 伊紅染色，以進(jìn)一步驗(yàn)證感染性骨缺損模型的建立。驗(yàn)證造模成功后，腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉剩余 30 只家兔，暴露感染性骨缺損區(qū)后進(jìn)行簡單清創(chuàng)和沖洗，采用隨機(jī)數(shù)字表法分 3 組干預(yù)：空白組 (n=10)

　　不做任何處理，對(duì)照組 (n=10)骨缺損區(qū)注射 0.5mL 透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠，實(shí)驗(yàn)組(n=10)

　　骨缺損區(qū)注射 0.5mL 載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠，逐層縫合切口。術(shù)后允許家兔自由活動(dòng)。注射 12 周后，麻醉后處死所有家兔，獲取左前臂橈骨標(biāo)本并保存在 40g/L 多聚甲醛溶液中，以進(jìn)行后續(xù)相關(guān)檢測(cè)。

　　Micro-CT 掃描：獲取橈骨標(biāo)本后，通過 Micro-CT 掃描分析骨再生情況，使用多模態(tài)三維可視化軟件重建每個(gè)樣本的三維圖像，對(duì)缺損部位指定感興趣區(qū)域內(nèi)的骨體積分?jǐn)?shù)和骨密度進(jìn)行分析，以定量分析新骨形成。

　　組織形態(tài)觀察：橈骨樣本在 Micro-CT 掃描后進(jìn)行分級(jí)乙醇系列脫水和脫鈣處理，然后將樣本固定在石蠟中，切成 3.0-4.0μm 厚的切片，分別進(jìn)行蘇木精 - 伊紅、Masson 三色與吉姆薩染色，置于顯微鏡下觀察并拍照。

　　RT-qPCR 檢測(cè)：提取切口處的肉芽組織，使用快速提取法提取組織總 RNA，采用 RT-qPCR 檢測(cè)腫瘤壞死因子 α、白細(xì)胞介素 6 mNRA 表達(dá)。檢測(cè)方法同上。基因引物設(shè)計(jì)見表 1。

　　免疫組化染色：將脫鈣后的骨組織包埋于石蠟中，然后切成 5μm 大小的薄片，將切好的薄片分別與 RUNX2 和骨鈣素抗體在 4℃下孵育過夜，與異硫氰酸熒光素綴合的山羊抗兔疫球蛋白 IgG 抗體孵育 1h，置于顯微鏡下觀察圖像并拍照，使用 Image J 軟件計(jì)算 RUNX2 和骨鈣素陽性細(xì)胞數(shù)量。

　　1.5 主要觀察指標(biāo)

　　載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠的形貌、力學(xué)性能及體外藥物釋放、生物相容性、抗菌、促成骨分化性能，以及體內(nèi)修復(fù)感染性骨缺損的效果。

　　1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均從 3 個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中獲得，并以 x±s格式表示。使用 SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較進(jìn)行 t 檢驗(yàn)或單因素方差分析。

　　P<0.05

　　為組間差異有顯著性意義。該文統(tǒng)計(jì)學(xué)方法已經(jīng)西安市中心醫(yī)院生物統(tǒng)計(jì)學(xué)專家審核。

　　2. 結(jié)果

　　2.1 載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠的構(gòu)建及表征

　　載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠具有穩(wěn)定的成膠性能;掃描電子顯微鏡下可見載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠具有良好的多孔結(jié)構(gòu)，孔徑在 100-300μm 之間。對(duì)載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠進(jìn)行流變檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，水凝膠的儲(chǔ)能模量(G’)始終大于耗能模量(G’’)，證實(shí)該水凝膠具有良好的力學(xué)性能。載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠的體外藥物釋放曲線顯示，在最初的 1 周內(nèi)萬古霉素呈現(xiàn)快速釋放，釋放的藥物量為 (37.07±2.61)%，而后藥物釋放逐漸減緩，在第 42 天釋放達(dá)到平衡，萬古霉素的持續(xù)釋放量為 (58.54±3.94)%。

　　2.2 載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠的生物相容性

　　培養(yǎng) 1、3d 的活死染色結(jié)果顯示，各組的活細(xì)胞數(shù)量(綠色熒光)明顯多于死細(xì)胞數(shù)量(紅色熒光)，并且 3 組之間活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)量無明顯差別，見圖 2A 所示。CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，各組細(xì)胞吸光度值增加，相同培養(yǎng)時(shí)間下 3 組細(xì)胞吸光度值比較差異無顯著性意義(P>0.05)，見圖 2B 所示，表明載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠具有良好的體外生物相容性。

　　3 討論

　　在骨缺損修復(fù)過程中，病原菌引起的感染是影響局部組織和骨再生能力的重要因素 [25]。病原體可通過釋放酸性物質(zhì)和蛋白酶等方式直接損傷細(xì)胞外基質(zhì)成分，降低骨修復(fù)能力，但更重要的是可以通過直接抑制成骨細(xì)胞和促進(jìn)破骨細(xì)胞形成來抑制骨再生 [26]。根據(jù)這一病理機(jī)制，此次實(shí)驗(yàn)將萬古霉素負(fù)載到透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠內(nèi)構(gòu)建了一種可注射藥物遞送系統(tǒng)，通過局部緩釋萬古霉素抑制細(xì)菌的增殖并改善軟局部成骨微環(huán)境，從而促進(jìn)骨再生。

　　萬古霉素是一個(gè)高度交聯(lián)的七肽糖苷配基結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)使其能夠與細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖前體末端結(jié)合來發(fā)揮作用，尤其是革蘭陽性菌，是治療耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌感染的首選藥物 [37]。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠能夠早期迅速釋放萬古霉素，并且體外抗菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)，載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠能夠同時(shí)殺滅大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，并且抑菌效果長達(dá) 48h;體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)表明，該復(fù)合水凝膠植入體內(nèi)后可以有效殺滅金黃色葡萄球菌，減輕感染狀態(tài)。

　　對(duì)于骨科植入物來說，除了關(guān)注抗菌活性，其生物相容性和成骨活性更應(yīng)得到重視。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在加入萬古霉素前后透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠的生物相容性不發(fā)生明顯變化，未對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的活性造成影響。堿性磷酸酶是一種早期成骨分化標(biāo)志物，在細(xì)胞外基質(zhì)成熟后表達(dá)，參與骨重建過程 [25]。此次實(shí)驗(yàn)研究了載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠體外對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響，結(jié)果證實(shí)載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠可以促進(jìn)早期及晚期的成骨分化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖凝膠可以通過促進(jìn) RUNX2 及骨鈣素的表達(dá)、抑制金黃色葡萄球菌的活性，在體內(nèi)促進(jìn)感染性骨缺損的骨修復(fù)。

　　已有研究表明，透明質(zhì)酸可以通過和鈦納米管結(jié)合來實(shí)現(xiàn)藥物的可控性，并且通過聚多巴胺修飾后搭載萬古霉素能夠?qū)崿F(xiàn)更好的抗菌性能 [27-28]。此次實(shí)驗(yàn)采用橈骨中段切除填充浸泡金黃色葡萄球菌菌液明膠海綿的方法來誘導(dǎo)家兔感染性骨缺損模型，相較于股骨鉆孔并且直接注射金黃色葡萄球菌菌液誘導(dǎo)感染的方法，直接切除橈骨并且使用可吸收明膠海綿填充具有造模穩(wěn)定且簡單的優(yōu)點(diǎn)。家兔橈骨顯露容易且具有非承重性，切除后不需要額外固定 [29]。

　　此次實(shí)驗(yàn)以透明質(zhì)酸和氧化葡聚糖作為基礎(chǔ)材料構(gòu)建了具有良好生物相容性和藥物緩釋性的載體，通過局部微創(chuàng)注射方式將萬古霉素遞送至感染性骨缺損部位，維持有效藥物濃度的同時(shí)減輕了藥物帶來的不良反應(yīng)。載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠具有良好的孔隙結(jié)構(gòu)，這種多孔隙結(jié)構(gòu)有利于萬古霉素在水凝膠網(wǎng)絡(luò)內(nèi)自由擴(kuò)散，并緩釋到周圍微環(huán)境中 [38];使用可吸收明膠海綿可以局限金葡菌菌液防止菌液流失，有效誘導(dǎo)感染。載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠注射可以通過抑制缺損局部細(xì)菌的增殖來阻礙感染的發(fā)展，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，改善缺損局部的成骨微環(huán)境，從而促進(jìn)骨再生。

　　然而，該研究也存在一定的局限性和不足：并未設(shè)置萬古霉素的濃度梯度來進(jìn)行療效的比對(duì)，并且關(guān)于體內(nèi)體外抗菌性的驗(yàn)證不夠全面，詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)一步探究。此外，該水凝膠具有良好的力學(xué)性能，保證了在注射過程中不會(huì)發(fā)生形變 [30]。體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)表明，水凝膠中萬古霉素在初始的 7d 內(nèi)存在快速釋放情況，這是由于藥物釋放主要通過材料降解和擴(kuò)散進(jìn)行調(diào)節(jié)，在初始階段，水凝膠尚未開始降解，藥物主要通過自由擴(kuò)散釋放，這也有利于萬古霉素在短時(shí)間內(nèi)快速達(dá)到有效濃度 [6,31];而后緩慢釋放長達(dá) 49d，釋放量達(dá)到將近 60%，滿足臨床用藥時(shí)間需求 [21,32]。總的來說，此次實(shí)驗(yàn)制備的復(fù)合水凝膠展現(xiàn)了較好的孔隙率、力學(xué)性能以及藥物緩釋性能，這對(duì)萬古霉素在局部持續(xù)釋放、減少局部不良反應(yīng)具有重要意義。

　　此次實(shí)驗(yàn)以透明質(zhì)酸和氧化葡聚糖混合凝膠作為載體，通過物理共混的方法將萬古霉素裝載入復(fù)合水凝膠中，從而構(gòu)建了一種具有抗菌和促成骨雙功能的藥物緩釋體系，該復(fù)合水凝膠在體外展現(xiàn)了良好的緩釋性能、生物相容性、抗菌性能與促成骨性能，并且該復(fù)合水凝膠通過在感染性骨缺損局部釋放萬古霉素殺滅局部病原菌、改善成骨微環(huán)境，從而抑制了感染的發(fā)展，有效促進(jìn)骨再生。因此，作為一種新型的可注射雙功能水凝膠制劑，載萬古霉素透明質(zhì)酸 / 氧化葡聚糖水凝膠可在原位緩釋并保持萬古霉素的療效，從而調(diào)節(jié)骨再生，為移植物相關(guān)感染的治療提供了一種新途徑。

　　成骨細(xì)胞與細(xì)菌在植入生物材料表面的競爭黏附對(duì)于骨再生至關(guān)重要 [33]，如果細(xì)菌率先附著，會(huì)在植入物表面逐漸形成生物膜，隨后合成胞外多糖，進(jìn)而表現(xiàn)出對(duì)抗生素及免疫系統(tǒng)強(qiáng)大的耐受性，使感染難以去除，最終導(dǎo)致感染性骨不連 [34]。此次實(shí)驗(yàn)通過萬古霉素的原位釋放來抑制缺損部位金黃色葡萄球菌的增殖，從而改善缺損局部的成骨微環(huán)境。研究表明，細(xì)菌侵入后的 4 - 6h 是形成生物膜的關(guān)鍵時(shí)期 [34]。

任 波;唐永亮;李 妮;劉邦定,西安市中心醫(yī)院,202534