類黃酮是一大類植物次生代謝產物，具有多種有益健康的生物活性，山奈酚(KMF)作為重要的黃酮醇化合物，具有抗氧化、抗癌、抗菌和抗炎等廣泛的藥物和生物學特性，在醫藥和食品工業中應用潛力巨大。目前，KMF 主要通過傳統植物組織有機溶劑提取或化學合成獲得，但前者因植物中 KMF 含量低導致耗時、繁瑣、成本高，后者需多步驟、有毒試劑和極端條件，經濟和安全性不足，均限制了大規模生產。

　　隨著合成生物學發展，生物合成途徑成為新策略。KMF 生物合成中，黃烷酮 3 - 羥化酶(F3H)和黃酮醇合酶 1(FLS1)是關鍵酶，可催化柚皮素(NRN)轉化為 KMF。已有研究利用工程菌實現 KMF 合成，但存在操作復雜、耗時費力等問題。因此，本研究旨在利用自誘導培養基優化工程菌合成 KMF 的過程，提高產量和效率。

　　1 材料與方法

　　1.1 細菌菌株、質粒、試劑和 AIM

　　菌株與培養：大腸埃希菌 DH5α 和 BL21 (DE3) 用含 34 μg・mL⁻¹ 氯霉素的 LB 培養基培養。

　　質粒與酶：原核表達載體 pACYCDuet-1 用于克隆目的基因，限制性內切酶、T4 DNA 連接酶等購自相應公司。

　　試劑與培養基：標準品 NRN、DHK、KMF 及化學品購自 Sigma-Aldrich 公司。初始自誘導培養基(AIM)含胰蛋白胨、酵母提取物、(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₄、Na₂HPO₄、葡萄糖、乳糖和 MgSO₄等成分。

　　1.2 重組質粒構建

　　通過 PCR 擴增擬南芥來源的 AtFLS1 和 AtF3H 基因，克隆至 pACYCDuet-1 載體中，構建重組質粒 pACYCDuet-AtFLS1-AtF3H，其中 AtFLS1 插入 SalI 和 NcoI 位點，AtF3H 插入 NdeI 和 XhoI 位點。

　　1.3 工程菌中 KMF 的初始自誘導體系建立

　　將重組質粒轉化至大腸埃希菌 BL21 (DE3)，接種至含氯霉素和 0.5 mmol・L⁻¹ NRN 的初始 AIM 中，25℃振蕩培養 24 h，用乙酸乙酯提取類黃酮，甲醇溶解后進行 HPLC/ESI-MS 分析。

　　1.4 HPLC/ESI-MS 分析

　　將樣品用 50% 乙腈稀釋過濾后，按實驗室方法進行 HPLC/ESI-MS 分析，檢測類黃酮成分。

　　1.5 AIM 優化

　　乳糖濃度優化：在含 0.5 g・L⁻¹ 葡萄糖和 0.5 mmol・L⁻¹ NRN 的 AIM 中，設置乳糖濃度為 1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 g・L⁻¹，篩選最佳濃度。

　　葡萄糖濃度優化：在含 4.0 g・L⁻¹ 乳糖和 0.5 mmol・L⁻¹ NRN 的 AIM 中，設置葡萄糖濃度為 0、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 g・L⁻¹，篩選最佳濃度。

　　1.6 培養條件優化

　　溫度優化：在 25、35、45℃下培養工程菌，確定最佳反應溫度。

　　底物濃度優化：在含 0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol・L⁻¹ NRN 的 AIM 中，35℃培養 24 h，優化底物濃度。

　　反應時間優化：在含 2.0 mmol・L⁻¹ NRN 的 AIM 中，35℃分別培養 12、24、36、48 h，確定最佳反應時間。

　　1.7 統計分析

　　試驗結果以 “均值 ± 標準差” 表示，采用雙尾學生 t 檢驗評估組間差異顯著性，P<0.05 為顯著，P<0.01 為極顯著。

　　2 結果與分析

　　2.1 工程化大腸埃希菌 BL21 (DE3) 中 KMF 的初始自誘導體系建立

　　構建的重組質粒 pACYCDuet-AtFLS1-AtF3H 轉化至大腸埃希菌 BL21 (DE3) 后，在初始 AIM 中培養，HPLC/ESI-MS 分析顯示，培養物中產生保留時間為 10.37 min(m/z 285.1000，KMF)和 6.59 min(m/z 287.1000，DHK)的化合物，證實自誘導體系成功合成 KMF。

　　2.2 AIM 成分優化

　　乳糖濃度：KMF 產量隨乳糖濃度升高至 4.0 g・L⁻¹ 時達平臺期，確定最佳乳糖濃度為 4.0 g・L⁻¹。

　　葡萄糖濃度：KMF 產量隨葡萄糖濃度升高至 0.5 g・L⁻¹ 后下降，最佳葡萄糖濃度為 0.5 g・L⁻¹。

　　2.3 培養溫度優化

　　在 25、35、45℃下培養，KMF 產量在 35℃時達峰值，確定最佳培養溫度為 35℃。

　　2.4 底物濃度優化

　　隨 NRN 濃度增加至 2.0 mmol・L⁻¹ 時，KMF 產量達平臺期，底物轉化率隨濃度升高而降低，最佳底物濃度為 2.0 mmol・L⁻¹。

　　2.5 反應時間優化

　　反應時間延長至 24 h 時，KMF 產量達平臺期，底物轉化率持續增加后趨緩，最佳反應時間為 24 h。

　　2.6 優化前后 KMF 產量對比

　　優化后 KMF 產量從(97.89±3.64)mg・L⁻¹ 提高至(212.46±3.22)mg・L⁻¹，為優化前的 2.17 倍;底物轉化率從(66.15±1.16)% 提高至(85.87±0.49)%，顯著提升合成效率。

　　3 討論

　　本研究通過優化自誘導培養基(AIM)的葡萄糖、乳糖濃度及培養溫度、底物濃度、反應時間等參數，顯著提高了 KMF 產量和底物轉化率。AIM 中葡萄糖和乳糖的代謝順序影響基因表達，高濃度葡萄糖因碳分解代謝物阻遏效應抑制 KMF 合成，而優化后的乳糖濃度可有效誘導靶蛋白表達。與傳統 IPTG 誘導方法相比，自誘導體系無需監測細胞密度和添加誘導劑，操作簡便、成本低、適合工業化放大生產。

　　研究也指出未來優化方向，如篩選不同來源的 F3H 和 FLS1 酶、優化密碼子、固定化工程菌、選育高產菌株或采用補料分批培養等，以進一步提升 KMF 產量和降低成本。

陳 磊;張智萍;廖 凱;張新躍,揚州大學生物科學與技術學院,202405