引言

　　細菌廣泛存在于食品藥品生產、環境監測監管和臨床醫療工作等領域，對人類健康與安全構成多方面的威脅。細菌檢測對食品藥品和環境安全的維護，以及對感染性疾病的防控至關重要。近年來，隨著細胞治療技術的快速發展，對產品質量的快速檢測也提出了更高的要求。《GMP 附錄 - 細胞治療產品》中明確指出 “細胞治療產品的生產全過程應當尤其關注防止微生物污染”，而細菌檢測則是細胞治療產品放行的重要評價參數之一。由于細胞治療類產品有效期極短，精準快速地檢測出可能存在的細菌是保證其臨床用藥的安全性和時效性的關鍵所在。目前，平皿計數法、多管發酵法、濾膜法等被視為 “金標準” 的傳統細菌檢測技術因操作復雜、耗時較長等已經越來越難以滿足快速性、實時性、高靈敏度等方面的需求。細菌快速檢測技術也因此應運而生，成為國內外研究的熱點。

　　液滴微流控分析技術是近年發展起來的高精度定量分析方法，在生物醫學與食品營養等領域均有頗多應用。這項技術的原理是在微流控平臺上通過特定的方法生成數以萬計的內含特定物質的液滴，并對液滴中所發生的物理、化學、生物過程或反應時所產生的信號進行識別判讀，以區分陰性與陽性液滴，然后根據泊松分布原理進行計算，從而實現對目標檢測物的絕對定量分析。與傳統定量分析技術不同，液滴微流控分析技術無須依賴標準樣品即可實現絕對定量分析，其在檢測靈敏度和定量分析精度等方面也顯著優于傳統定量分析技術。因此，液滴微流控分析技術的出現為細菌快速檢測提供了新的方向和機遇。本文結合作者們的自身工作，對近年來液滴微流控分析技術在細菌檢測中的應用進行了總結，并就其應用前景進行了展望。

　　1 液滴微流控分析技術簡介

　　液滴微流控技術是微流控技術領域的一個分支，該技術旨在將原本連續的流體轉換成多個單獨的、離散的微液滴，并對這些液滴進行操控。液滴微流控分析技術則是一種基于液滴微流控的分析技術，在操控液滴的基礎上通過特定的方式對其進行分析。自 He 等 [12] 于 2005 年首次實現液滴式單細胞捕獲至今，液滴微流控分析技術已在微生物培養、微生物檢測與特征描述、抗生素敏感性測試、微生物相互作用以及微生物技術等眾多微生物學相關領域得到了廣泛的應用。

　　液滴微流控分析過程中最主要的 3 個步驟包括目標物隨機封裝、孵育及信號檢測。液滴生成是實現目標物隨機封裝的關鍵，在該過程中大體積樣本被離散成數千至數百萬個微滴，根據泊松分布原理，使每個液滴至多包含 1 個目標物。液滴在微流控芯片中的生成和存在形式主要包括 2 種。一種是通過光刻技術制造微井 / 微籠等微結構，從而平行地形成液滴陣列。但受限于微井 / 微籠的數量，導致可檢測的體積較小，并且芯片結構復雜，加工較為困難;另一種是通過微通道及對界面特性的控制生成液滴并懸浮于不混溶的載液中，該形式是一個連續過程，理論上不存在待測樣本體積限制，但在處理大體積樣本時耗時較長。常見的液滴生成結構包括 T 型結構、流動聚焦結構及共軸結構，這類結構僅含單一生成模塊，通量小，生成頻率約 1000Hz。液滴生成總頻率與生成模塊的數量直接相關，增加液滴生成模塊是實現高通量的液滴生成的常用方法，例如可以并行多個流動聚焦結構或采用多層結構。但這類芯片往往體積過大、芯片利用率偏低、加工成本較高。隨著液滴生成結構的不斷優化，階梯乳化結構的提出實現了超高通量的液滴生成。該結構能集成數百個液滴生成口，生成速率可達 8.2L/h，超高通量液滴生成讓大體積樣本的處理和檢測成為可能。

　　液滴孵育是信號產生的過程。常見的信號類型包括熒光、散射光、光譜、圖像、電信號、質譜、核磁共振譜等，而檢測速度、準確度、精密度和靈敏度等因素則受不同信號類型與檢測方式的影響。將待測樣本處理成小體積液滴的過程中，各待測單元中背景信號強度顯著降低，待測目標物濃度呈數量級的增高，從而提高了信噪比和檢測靈敏度，并縮短了檢測時間。液滴大小也是影響檢測的關鍵因素之一，其主要取決于液滴生成處的幾何尺寸和兩相流速。大于數百納升的液滴容易破裂，在連續流動液滴微流控分析中應用較少;而體積遠小于 1pL 的液滴盡管已經可以用現有技術生成且可以使信噪比和檢測靈敏度顯著提升，但亞微米的尺度會使光學顯微鏡成像的難度大幅增加。除此之外，樣本中待測目標物的濃度是影響檢測信號的另一關鍵因素，根據泊松分布原理，較高的濃度，會增加單個液滴包裹多個目標物的概率，從而影響定量分析結果的準確性;而較低的濃度，則會增加空液滴的比例，延長了從開始檢測到第一個陽性液滴的時間。若液滴的體積過小，則會降低檢測系統的體積通量，從而延長整個檢測的周轉時間。因此，液滴體積和待測樣品體積之間的優化非常重要。在完成液滴孵育、信號達到檢測閾值后即進入檢測階段，通過光學顯微鏡或其他設備進行陰性和陽性信號識別，完成定量分析過程。

　　綜上所述，液滴微流控分析技術有以下 4 個優點：(1)高通量，能同時進行數百萬的生化反應;(2)高靈敏度，飛升至納升級液滴可顯著降低各待測單元中的背景干擾，并提高待測目標物濃度;(3)快速，能更快地產生信號;(4)絕對定量，將單個標靶封裝到液滴中進行定量分析而不依賴于標準樣品。

　　2 液滴微流控分析技術在細菌檢測中的應用

　　液滴微流控通常利用氟化油和表面活性劑作為液滴載體以使其穩定存在，這樣既可創建一個防止液滴內容物與管壁非特異性吸附的界面，又可以提供液滴內容物間特異性結合的封閉反應體系。這種體系穩定性和生物相容性為細菌檢測提供了一種相對理想的外部環境。此外，液滴微流控分析技術可將單個細菌細胞從龐大的混合體系中分離出來，通過縮小體積的方式實現單細胞信號(如代謝產物、分泌因子等)的快速累積，不但縮短了信號達到檢測閾值的時間，還可以結合高速檢測設備在短時間內實現數百萬液滴的分析，從而為細菌的快速檢測提供了可能。液滴微流控分析技術的細菌檢測原理主要包括代謝增殖、核酸擴增和單細胞分析等，液滴中信號的檢測方式主要包括一維(1D)、二維(2D)和三維(3D)檢測等。

　　2.1 檢測原理

　　2.1.1 基于代謝增殖的檢測

　　細菌在合適的條件下代謝增殖形成菌落形成單位(colony forming unit, CFU)，可用于粗略評估其數量。但這種傳統方法面臨 2 個困難：(1)菌落的形成往往需要培養數天，耗時較長;(2)該方法無法檢測具有活性但無法培養(viable but non-culturable, VBNC)的細菌。而液滴微流控分析技術通過統計陽性液滴數進行評估，而液滴中信號的產生一般只需培養幾個小時，顯著縮短了檢測時間。刃天青是一種代謝標記試劑，能被活細菌代謝產生的還原劑 [如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)和黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FADH)] 還原為具有強紅色熒光的試鹵靈。因此，液滴中的熒光強度與細菌的存在和代謝活動密切相關，細菌代謝越活躍，產生的還原劑越多，從而使熒光信號增強。因此，熒光強度可作為細菌活性的指示指標，可用于活細菌檢測。刃天青結合液滴微流控分析技術最短能在 1h 內檢測到熒光信號，這意味著細菌只需復制幾次便能使熒光信號達到檢測閾值，其檢測限(limit of detection, LOD)可達 50CFU/mL，低于常規的細菌檢測方法。但刃天青 / 試鹵靈作為非特異性染料，僅能反映細菌的整體代謝活動，無法直接區分不同菌屬。要實現特異性檢測，通常需要結合選擇性培養基特異性分子探針或基于核酸的檢測技術，這些方法可在液滴微流控系統中增強檢測的專一性。對于多種細菌的同時檢測，液滴微流控技術通過生成獨立液滴，實現多個樣本的并行處理，結合不同條件下的熒光信號表現，可以實現多菌群的檢測，而進一步結合特異性方法則可區分不同菌屬。除了上述還原反應外，培養過程中諸如乙醇等代謝產物，以及 pH 值、氧分壓等的變化，也可結合熒光指示劑作為陽性信號識別的依據。不過這類方法受細菌生長繁殖條件和時間的限制，檢測時間相對較長，操作較為煩瑣。

　　細菌增殖引起的散射光變化、滲透壓變化、微波共振振幅和頻率、電容(檢測范圍為 86.5–8650CFU/droplet，LOD 為 63.66CFU/droplet)、電阻抗、實時圖像等免標記(label-free)信號也都可用于陽性液滴的識別。Cui 等 [44] 利用基于液滴濁度成像的數字標準板計數(digital standard plate count, dSPC)方法，在 6h 內準確定量大腸桿菌(Escherichia coli)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)樣本，LOD 為 100CFU/mL，計數結果與標準平板計數無顯著性差異，檢測耗時降至標準平板計數法的 1/3。Hussain 等 [45] 通過獲取孵育過程中的散射光數據，并結合機器學習分類方法，在 6h(培養 5h，檢測 1h)內完成銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的檢測。另外，將日新月異的人工智能技術引入細菌檢測過程中的信號處理步驟，有望消除人工判定時的主觀因素并大大縮短讀出時間，為實現快速檢測提供了新思路。

　　基于代謝的檢測方法雖然可實現細菌廣譜檢測，但在靈敏度、準確度、精密度及檢測速度上仍不及熒光標記類方法。此外，另一個值得關注的問題是如何檢測細菌的一個特殊形式 —— 芽孢。其無代謝的深度休眠狀態給基于代謝的快速檢測技術帶來了極大挑戰。目前較為常用的檢測方式是先誘導芽孢萌發，再通過一些光學和電化學的手段監測其萌發過程。

　　2.1.2 基于核酸擴增的檢測

　　液滴數字核酸擴增檢測通過將樣本 DNA 隨機封裝至液滴中，使每個液滴中包含或不包含一個目標分子(DNA 模板)，之后將所有獨立的液滴反應單元進行平行擴增后對每個液滴進行檢測，通過熒光信號識別陽性液滴，最后依據泊松分布算法得出初始樣本的核酸拷貝數，從而不再需標準曲線。基于液滴中核酸的擴增方法包括液滴數字化聚合酶鏈式反應(droplet digital polymerase chain reaction, ddPCR)與液滴數字化環介導等溫擴增(droplet digital loop-mediated isothermal amplification, ddLAMP)等。

　　ddPCR 具有檢測時間短、靈敏度高等特點，在細菌檢測方面已有諸多應用。例如利用液滴微流控檢測葡萄酒中生物胺的產生菌;在 2h 內同時完成污染飲用水樣本中致病性大腸桿菌 O157 和單核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的檢測，LOD 均低至 10CFU/mL;在超過 10 萬個正常的大腸桿菌 K12 細胞的高背景下，檢測到罕見病原菌大腸桿菌 O157:H7。通過集成其他技術，還可以進一步提高 ddPCR 的檢測速度和靈敏度。Abram 等 [60] 集成一步式 ddPCR 檢測與高通量 3D 粒子計數系統，可在 1h 內以 10CFU/mL 的靈敏度直接從全血樣本中進行細菌檢測，而不再需要血液培養或樣本處理。相比之下，傳統的實時 PCR 和 ddPCR 的檢測限分別只能達到 1000CFU/mL 和 50–100CFU/mL。該系統被進一步證明能應用于抗生素耐藥基因檢測、新菌種發現和廣譜細菌檢測。

　　加熱循環過程在 PCR 中必不可少。此過程需要專門的儀器和較長的分析時間，從而限制了其在現場檢測中的應用。而環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是在等溫狀態下對靶基因進行擴增，無須穩定的加熱步驟，近年來被認為是一種有希望替代 PCR 的核酸檢測技術。相較于傳統 LAMP 技術，結合了液滴的 ddLAMP 技術在靈敏度、檢測速度和通量方面更具優勢，也在多個領域的細菌檢測中得到應用。如 ddLAMP 在用于多種食源性病原體檢測時，LOD 是傳統 LAMP 方法的 1/500;在用于水樣中糞腸球菌(Enterococcus faecalis)檢測時，LOD 為 1000CFU/mL，檢測時間為 1h，證明了 ddLAMP 技術在水資源監測方面的巨大潛力;ddLAMP 技術也被用于牛奶樣品中鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella enterica)的檢測(靶向 invA 基因)，LOD 為 5000CFU/mL;ddLAMP 技術還可以用于結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的檢測，可在 50min 內自動完成 10 個結核分枝桿菌樣品的并行檢測，LOD 為 10 個細菌。此外，在 ddLAMP 的基礎上還可結合其他技術實現無標記檢測。Teixeira 等 [66] 將表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)與 ddLAMP 技術相結合，開發了一種基于液滴的食源性病原體檢測光流體系統，該系統成功在超高溫牛奶中檢測到單核增生李斯特氏菌。

　　ddPCR 和 ddLAMP 較傳統的熒光定量 PCR 而言，還有一大優勢是易于實現集成化，避免了傳統儀器多級操作的缺點，從而降低了潛在環境污染(如氣溶膠)的風險，并進一步提高了檢測的準確度和精密度。該技術同時減少了化學試劑和樣品的消耗，提高了便攜性與自動化。不過數字 PCR 所需的試劑和儀器都相對昂貴，在大規模使用時需考慮成本問題。

　　總而言之，雖然基于核酸擴增的液滴分析具有快速、高靈敏度等特點，但由于此類方法一般需要先通過裂解細菌提取細菌核酸，再采用特異性的引物探針進行 PCR 等擴增檢測，即檢測對象是核酸這類生物大分子而非細胞，因此更適合于核酸類病毒的定量檢測。如果要實現細菌定量檢測則還需建立核酸拷貝數與細菌濃度的標準曲線。

　　2.1.3 基于單細胞分析檢測

　　單細胞分析是液滴微流控分析技術最大的特點和優勢之一。將單個細菌細胞直接或與熒光探針共同封裝在液滴中，通過酶促反應、免疫結合、核酸結合等形式產生熒光，根據熒光和 / 或散射光信號的改變來識別陽性液滴，實現初始樣本中細菌的絕對定量。這種檢測形式規避了傳統檢測的培養過程，顯著縮短分析時間，尤其適用于較難培養的菌株，而在靈敏度和檢測成本等方面也更具優勢。

　　酶是活細胞內極其重要的生物催化劑，部分酶可作為活細胞檢測的生物標志物。β 葡萄糖醛酸苷酶和 β 內酰胺酶是具有代表性的典型例子。β 葡萄糖醛酸苷酶熒光探針 4 - 甲基傘形酮 -βD - 葡糖苷酸(4-methylumbelliferyl-β-D glucuronide, 4-MUG)和 β 內酰胺酶熒光探針 CDG-OMe 結合液滴微流控可分別用于檢測大腸桿菌和結核分枝桿菌，LOD 均可達到 10CFU/mL。但由于較強的特異性，使得這類探針只能檢測單一類型的細菌。DNAzyme 則是一種通過體外進化從隨機文庫中人工合成出來的具有催化活性的單鏈 DNA 寡核苷酸，能根據檢測目標選擇合成對應的 DNAzyme，達到靈活檢測的目的，在病原菌檢測與疾病診斷方面有諸多應用。

　　Rauf 等 [73] 設計了一種包含 DNAzyme 傳感器、液滴微流控芯片與計算機視覺功能的大腸桿菌計數器;該 DNAzyme 傳感器是包含了 2 個寡核苷酸 FS1 和 EC1T 的反作用 DNAzyme 探針，其中 FS1 寡核苷酸功能化了熒光團和淬滅劑;他們先將大腸桿菌加溫破裂，使 EC1T 與原生胞內物質中的特定靶向物綁定;于是 FS1 在 EC1T 的催化下裂解，熒光團產生熒光信號;此方法對大腸桿菌的檢測具有很高的特異性。Liu 等 [74] 設計了一種用于檢測病原細菌的類鉤形 DNAzyme 活化的自催化生物傳感器，這種創新方法巧妙地將識別元素 DNAzyme 與等溫、無酶自催化的雜交鏈式反應和催化發夾自組裝相結合，以實現強大的信號放大，該生物傳感器在1.5×103−3.7×107CFU/mL范圍內對細菌表現出良好的線性響應，并且檢測限達到了1.3×103CFU/mL。另外，這種通用檢測平臺僅需對鉤狀連接器模塊進行修改，即可識別包括大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和腸沙門氏菌(Salmonella enterica)在內的各種病原細菌。DNAzyme 技術的應用已經得到全面提升，在推動病原細菌檢測和公共衛生監測方面具有巨大潛力。

　　液滴技術可以與免疫反應結合，應用于細菌檢測。例如，Brian 等 [75] 將熒光標記的鼠傷寒沙門氏菌抗體與鼠傷寒沙門氏菌共同包裹到液滴中進行培養，熒光標記的抗體與細菌結合，使細菌表面的熒光強度增加;隨著細菌的增殖，熒光信號進一步增強，通過成像檢測，實現了無須清洗的檢測方法;該方法的檢測時間小于 5h，并且具有 100% 的特異性。Golberg 等 [76] 和 Schemberg 等 [77] 則利用免疫磁珠復合物直接捕獲樣本中的細菌以實現濃縮，從而提高液滴包裹效率并減少液滴生成所需的時間;具體來說，首先通過抗體功能化的磁珠與樣本中的細菌結合，達到捕獲目的;然后基于磁分離技術去除殘余溶液進行濃縮，接著將磁珠與熒光標記的抗體共同包裹到液滴中進行孵育，最后進行成像檢測。

　　此外，Chen 等 [78] 利用液滴微流控系統將生成的海藻酸鈉液滴引入含抗體和氯化鈣的緩沖鹽溶液中，在鈣離子與海藻酸的酸基交聯過程中，抗體被固定在海藻酸鹽微球的多孔網絡上，從而制備了抗體功能化的海藻酸鹽微球;接著，將微球加入含有預先熒光標記細菌的溶液中進行特異性結合實驗;結果表明，海藻酸鈉微球的高比表面積提高了檢測靈敏度。然而，類似于酶促反應，免疫結合的高特異性限制了檢測方法的通用性，并且檢測成本較高。因此，將酶促反應與免疫結合的液滴微流控分析技術更適用于特定致病菌或病原體的檢測。

　　16S rRNA 基因存在于所有細菌的基因組中，常作為細菌多樣性分析的標準。Guan 等 [79] 通過 RNA 探針 - 磁珠復合物識別細菌的 16S rRNA 基因，結合液滴微流控技術，無須逆轉錄和 PCR 擴增過程即可實現細菌的絕對定量檢測;具體來說，他們首先讓目標 RNA 與連接到磁珠上的 DNA 捕獲探針雜交，然后再與酶標記的單鏈 DNA 檢測探針雜交，為去除未結合的檢測探針，每次雜交后都需對磁珠進行洗滌;帶有雜交復合物的磁珠隨后被封裝到大量液滴中，與酶底物混合、孵育，并在單個集成微流控芯片中直接檢測，從而實現了簡便的數字檢測，無須在儀器之間轉移物料。相較于傳統核酸探針，肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)等修飾核酸雜交更快、穩定性更好，結合液滴微流控能更快檢測到病原體的 16S rRNA [80]。

　　Hsieh 等 [81] 利用液滴微流控分析技術，結合熒光 PNA 探針進行了病原體鑒定和抗生素敏感性測試，該探針可識別近 90% 的尿路病原體，在 30min 內完成最低處理尿液樣本的尿路感染診斷，這是迄今為止最快的尿路感染診斷方法。相較于單鏈 PNA 探針，雙鏈 PNA(double stranded peptide nucleic acid, dsPNA)探針具有更高的熒光信號和更好的靈敏度與特異性。因為在單鏈情況下，探針通常為發卡結構或分子信標結構，未結合目標 RNA 時，探針的一端具有相鄰的熒光團和淬滅劑，使熒光被淬滅;當與目標 RNA 結合后，發卡結構被打開，熒光團和淬滅劑之間的距離增加，導致熒光信號強度變化。

　　而在雙鏈情況下，探針由一條長鏈和一條短鏈雜交形成雙鏈結構，未結合目標 RNA 時，熒光團和淬滅劑也相鄰，熒光被淬滅;在目標 RNA 存在時，長鏈與目標 RNA 結合，短鏈被置換，導致熒光團與淬滅劑分離，顯著增強熒光信號。此外，雙鏈 PNA 探針因其形成的穩定雜交結構，具有更高的穩定性和親和力，從而提供更高的靈敏度和特異性。Mach 等 [82] 設計了一組 dsPNA 探針，結合液滴微流控技術實現了多種致病細菌 [包括真細菌、腸桿菌科細菌和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)] 的檢測。不依賴于核酸擴增的核酸探針結合液滴微流控分析技術的分析方法具有高特異性、高靈敏性和檢測速度快的特點，在細菌快速檢測中有較好的應用前景。

　　單細胞拉曼光譜能反映細胞的復雜性質，包括基因表達、細胞組成、特征結構和代謝狀態等。而液滴的連續運動使液滴成分均勻混合，從而解決了顆粒不均勻分布而導致的 SERS 信號不均勻的問題。將拉曼光譜與液滴微流控技術結合，可用于快速、無損、免標記的單細胞表征和鑒定。Lu 等 [88] 將液滴微流控分析技術與 SERS 結合用于快速鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，在 3.5h 內收集了 58 個金黃色葡萄球菌分離菌株的 17400 個 SERS 光譜。但該方法的檢測速度較低(約 1.4 droplets/s)，通過基于磁珠的目標物富集可降低樣本體積，進而縮短檢測時間 [89]。目前利用表面增強共振拉曼光譜(surface-enhanced resonance Raman spectroscopy, SERRS)能獲得單個液滴的 50 多個光譜，獲得單個光譜的時間縮至 20ms [90]。基于 Surface-enhanced raman spectroscopy(SERS)的液滴微流體系統具有高靈敏度的優勢，適用于細菌菌種的鑒定。

　　總體而言，液滴微流控分析技術與傳統快速檢測技術相比，檢測速度更快，準確度、精密度和靈敏度更高。根據泊松分布原理，可實現每個液滴中至多包含 1 個細胞，具備絕對定量的能力。不同的檢測手段各有利弊，由于實際菌種的復雜多樣性，各種方法都有待進一步優化，在不同的研究背景下，可以選擇不同的檢測手段來達到研究目的。簡而言之，熒光標記類方法的信號強度高、具有較高的特異性與靈敏性，但通用性較差，通常只能檢測對應的 1 種或幾種細菌;免標記類方法雖然具有一定通用性，但信號強度較弱，檢測時間較長或需長時間的培養過程。因此，一種細菌通用快速標記方法的開發是實現細菌快速檢測的關鍵。肽聚糖存在于所有細菌的細胞壁中，是理想的通用性靶點。Hudak 等 [93] 利用化學標記方法實現了對小鼠腸道微生物細胞壁的標記，但這種方法需要清洗，并不適合液滴微流控分析技術。若能實現免清洗標記，有望能解決該問題。此外，家蠶幼蟲血漿(silkworm larvae plasma, SLP)也能在肽聚糖的作用下誘導生成黑色素，用于檢測細菌 [94]。雖然有研究表明黑色素的產生與細菌數量無明確相關性，但結合液滴微流控分析技術單細胞分析的特點，有望實現對廣譜細菌的絕對定量 [95]。

　　2.2 檢測方式

　　液滴檢測時的檢測方式與通量也是影響細菌快速檢測的重要因素。現有檢測方法絕大多數依賴于光學檢測，根據光學檢測時液滴的排布方式可將檢測方法分為 1D、2D 和 3D 檢測。

　　在 1D 檢測方式中，液滴逐一通過檢測區，呈線性排布，該檢測過程為連續過程，檢測通量較小，一次只能檢測單個液滴，其檢測速度與流速、信號捕獲效率相關。為了提高檢測的靈敏度，可將檢測區流道變窄，使得液滴在經過檢測區時變為扁球形，以增加單個液滴的曝光時間 [22,68,81-82]。雖然 1D 檢測具有較高的準確度，但其流量相對較小，檢測耗時也相對較長。對于 2D 檢測方式，需先將生成的液滴富集至檢測區，再進行信號檢測，最后根據泊松分布原理計算出初始濃度。該類檢測方法多用于 PCR 與 LAMP 中，為防止多層液滴對檢測結果的影響，檢測區的液滴需要以單層、同一平面排布。此要求可以通過通道尺寸設計或借助液滴密度來實現 [96]。該檢測方式多結合圖像處理軟件進行分析，具有方便快捷的特點，但由于只是檢測部分液滴，因此準確度和精密度較低 [16,44,58]。3D 檢測方式實際上是一種 3D 粒子計數器，能在幾分鐘內從毫升體積樣本中檢測出單個熒光粒子。具體而言，液滴被包含在一個封閉的圓柱形試管中，試管可以水平旋轉和垂直平移來滿足掃描計數要求，掃描計數基于模式識別(而非熒光強度)。該方法可完成大體積樣本的檢測，檢測通量高(約 0.1mL/min)，大約每秒能檢測 10 萬個液滴 [91]。這 3 種檢測方式各有利弊，而 3D 檢測方式有較好的臨床應用前景。

　　3 展望

　　隨著食品、藥品、環境安全和臨床檢驗領域的飛速發展，傳統技術已無法滿足細菌快速檢測的需求。液滴微流控分析技術雖然已在細菌快速檢測中展現出了巨大的潛力，但未來仍需解決或優化 4 個主要問題：(1)突破待測樣本量的限制。臨床樣本體積多為毫升級，對于樣本輸入量在微升級的液滴微流控分析體系來說是一個巨大的挑戰。(2)信號檢測的及時性與精準性仍需進一步提高。(3)需要尋找新的細菌通用的特異性標記 / 免標記方法，在簡單樣本前處理甚至無需樣本前處理的條件下實現細菌的快速標記 [97]。(4)將檢測系統集成，使之便捷化、可攜帶，最終商業化。

　　前 2 個問題屬于工程學范疇，一個解決問題的思路是預先刨除確定不含細菌的那部分流體，不但可以減少待測流體的量，而且可以使含菌流體中的菌濃度升高，增強檢測信號。因此，一個較為可行的方法是在檢測前將細菌進行局部富集。而專門用于操控電中性生物顆粒的介電電泳(dielectrophoresis, DEP)技術則是一個有效的工具 [98-102]。例如，可以先用合適場強、頻率的 DEP 對待測流體進行預處理，在電極附近將細菌俘獲 [103]，再用合適的液滴形成法形成液滴，這樣可以顯著降低空液滴的比例。除了 DEP 外，其他例如免疫磁珠俘獲等技術也都可以達到類似效果 [104]。第 3 個問題則更偏向于理學范疇，如何尋找新的生物標識物進行檢測則是基礎研究人員需要積極思考的問題。至于最后一個問題，則需要來自公共衛生、微生物、微加工、電子信息及科研成果 / 專利產業化等領域的專家學者們通力合作、共同探討 [105-106]。

　　除此之外，在液滴生成和檢測技術方面，引入數字微流控(digital microfluidics, DMF)技術也不失為一種可行的方法 [107-108]。液滴微流控與傳統的連續流體微流控(continuous-flow microfluidics)均屬于管道式微流控，而數字微流控則是利用靜電力驅動離散的液滴。因為離散的液滴只能停留在特定的位置上(即驅動電極的上方)，換言之在每個特定位置上液滴只存在 “有” 或 “無” 2 種狀態(對應 “1” 或 “0”)，因而得其 “數字(digital)” 之名。DMF 具有液滴運輸、分割、合并等功能，雙極板結構 DMF 還具有液滴生成的功能。如果將 DEP 技術與液滴分割技術合用，先用 DEP 使細菌在液滴一側附近，再將液滴分割，即可實現細菌濃度的翻倍 [109]。在這之后可以聯用干式被動分配與濕式被動分配技術，使菌含量擴增，實現片上孵育 [110-111]。最后使用合適的光學或電化學檢測方法，即可顯著提高信號強度。但是 DMF 芯片加工相對復雜，目前基于 DMF 的微生物研究工作尚不多見，可能是未來發展的一個新方向 [112-118]。

　　我們相信液滴微流控分析技術的不斷完善與發展將為水環境監測、食品安全檢測、制藥微生物風險控制、細胞基因藥物無菌檢測、臨床醫學微生物檢驗等多個領域的研究與應用帶來新的希望。

黃子鳴;劉明;周露萍;吳文捷,浙江工業大學材料科學與工程學院;中國科學院杭州醫學研究所;浙江省腫瘤醫院,202505