摘要：深遠(yuǎn)海作為海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，具有獨(dú)特的生物多樣性特征，蘊(yùn)含了豐富的漁業(yè)資源。因此，對(duì)深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性實(shí)施高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)是開(kāi)展?jié)O業(yè)資源利用和管理的重要前提。然而，基于網(wǎng)具捕撈的傳統(tǒng)調(diào)查方法具有一定的局限性，eDNA 技術(shù)因其具有更廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景、更突出的成本效益、更高的檢測(cè)靈敏度和更精細(xì)的物種分辨率以及更低的分類階元偏向性等特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，可作為傳統(tǒng)調(diào)查方法的重要補(bǔ)充，并且在深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性監(jiān)測(cè)和漁業(yè)資源調(diào)查中具有廣闊的應(yīng)用前景。歸納總結(jié)了 eDNA 在魚(yú)類多樣性的研究現(xiàn)狀及其在深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性研究中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，同時(shí)結(jié)合深遠(yuǎn)海水域的環(huán)境特點(diǎn)，探討了 eDNA 技術(shù)在深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性研究中的應(yīng)用潛力以及可能面臨的相關(guān)挑戰(zhàn)，并為未來(lái)進(jìn)一步的研究工作提供系統(tǒng)的科學(xué)參考。

　　深遠(yuǎn)海是指水深大于 200m、遠(yuǎn)離大陸架公海以外的開(kāi)放水域，同時(shí)也是地球上最大、探索最少的生態(tài)系統(tǒng)之一。深遠(yuǎn)海作為海洋系統(tǒng)的重要組成部分，具有一系列不同于其他海洋生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境特征。總體而言，深遠(yuǎn)海因?yàn)楦采w面積大、環(huán)境異質(zhì)性以及不同時(shí)空尺度干擾下產(chǎn)生的斑塊群落，被認(rèn)為具有獨(dú)特的生物多樣性且蘊(yùn)含著豐富的漁業(yè)資源。

　　魚(yú)類作為深遠(yuǎn)海生態(tài)系統(tǒng)的重要類群之一，在生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中居于重要位置，絕大多數(shù)深遠(yuǎn)海魚(yú)類是連接底層營(yíng)養(yǎng)層級(jí)生物和頂層捕食者之間的重要聯(lián)系。典型的深遠(yuǎn)海魚(yú)類包含中上層、中層和深淵層魚(yú)類群落。其中，典型的中上層魚(yú)類群落包含金槍魚(yú)科、旗魚(yú)科、鯖科等類群;典型的中層魚(yú)類群落包括燈籠魚(yú)科、鉆光魚(yú)科、星光魚(yú)科等類群;典型的深淵層魚(yú)類包括綿鳚科、平鲉科、獅子魚(yú)科、長(zhǎng)尾鱈科等類群。深遠(yuǎn)海的魚(yú)類群落種類組成多樣、資源豐富，了解和掌握該海域魚(yú)類多樣性及其時(shí)空分布格局變動(dòng)規(guī)律，不但有利于深遠(yuǎn)海生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)與管理，更能為遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源的可持續(xù)利用提供重要參考。

　　然而，相較于近岸海域，深遠(yuǎn)海因面積較大、調(diào)查頻次不足、數(shù)據(jù)欠缺等原因，迄今為止對(duì)深遠(yuǎn)海生物多樣性調(diào)查和監(jiān)測(cè)相對(duì)有限，對(duì)于深遠(yuǎn)海的魚(yú)類區(qū)系和多樣性格局的了解仍較為欠缺。目前，有關(guān)海洋魚(yú)類多樣性調(diào)查一般采用中上層雙拖網(wǎng)、燈光圍網(wǎng)、燈光罩網(wǎng)、燈光敷網(wǎng)、延繩釣等傳統(tǒng)作業(yè)方式獲取生物樣本，但這些方法耗時(shí)耗力、規(guī)模受限，對(duì)棲息地和物種都具有顯著的選擇性，底拖網(wǎng)等網(wǎng)具還可能對(duì)生物多樣性和棲息地造成破壞，無(wú)法完全滿足調(diào)查有捕撈限制的水體和瀕危物種的現(xiàn)實(shí)需求，因此傳統(tǒng)調(diào)查方法在深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性調(diào)查中仍然存在一定的局限性。

　　此外，這些調(diào)查方法需要調(diào)查人員具備專業(yè)的形態(tài)鑒定基礎(chǔ)知識(shí)，在鑒定魚(yú)類的早期發(fā)育階段(魚(yú)類浮游生物)的樣品時(shí)尤其具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)轸~(yú)類浮游生物的個(gè)體小、區(qū)分困難，能用于鑒別可識(shí)別特征較少，用傳統(tǒng)方法識(shí)別和鑒定具有較大的難度。此外，基于傳統(tǒng)的網(wǎng)具捕撈方法在面積廣闊的深遠(yuǎn)海水域環(huán)境下開(kāi)展魚(yú)類多樣性和漁業(yè)資源調(diào)查及監(jiān)測(cè)，涉及的人力、物力等成本都十分高昂。所以，需要補(bǔ)充其他更加經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確且高效的魚(yú)類調(diào)查方式，以完善當(dāng)前深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性調(diào)查和監(jiān)測(cè)方面存在的薄弱環(huán)節(jié)。近年來(lái)出現(xiàn)的環(huán)境 DNA(Environment DNA，eDNA)技術(shù)，因其具有更廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景、更突出的成本效益、更高的檢測(cè)靈敏度、更精細(xì)的物種分辨率以及更低的分類階元偏向性等特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，有望為上述問(wèn)題提供新的思路和解決方案。

　　eDNA 的概念最早提出于 20 世紀(jì) 80 年代末，最初是應(yīng)用于微生物多樣性研究領(lǐng)域，后來(lái)進(jìn)一步拓展應(yīng)用于宏生物領(lǐng)域。廣義地說(shuō)，eDNA 包括存在于環(huán)境樣品(如水、冰、土壤、沉積物、生物膜、空氣)中的任何形式的 DNA。對(duì)于魚(yú)類等大型生物而言，eDNA 特指無(wú)須事先分離任何特定目標(biāo)生物，可從水、懸浮顆粒物、沉積物和冰雪等各類環(huán)境中直接獲得的遺傳物質(zhì)的總和，既包括生物排泄物、生殖細(xì)胞、脫落的皮膚及尸體等來(lái)源的細(xì)胞內(nèi) DNA，也包括細(xì)胞自然死亡及細(xì)胞內(nèi) DNA 解體等過(guò)程產(chǎn)生的細(xì)胞外 DNA。eDNA 與第 2 代測(cè)序技術(shù)(Next-generation sequencing，NGS)結(jié)合產(chǎn)生的 eDNA 宏條形碼技術(shù)(eDNA metabarcoding)，可以同時(shí)監(jiān)測(cè)水生生態(tài)系統(tǒng)的多個(gè)物種，進(jìn)而對(duì)群落水平的物種多樣性進(jìn)行研究，成為了生物多樣性研究的有力工具。另外，eDNA 結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Quantitative real-time PCR，qPCR)或數(shù)字 PCR(Digital PCR，dPCR)，可以定量檢測(cè)目標(biāo)物種的 eDNA 濃度，進(jìn)而分析物種的時(shí)空分布特征、估算物種豐度和生物量以及監(jiān)測(cè)物種的行為等。

　　本文圍繞 eDNA 技術(shù)在魚(yú)類多樣性的研究現(xiàn)狀、eDNA 技術(shù)在深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性研究中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)及其面臨的挑戰(zhàn)等方面展開(kāi)論述。同時(shí)，結(jié)合深遠(yuǎn)海的環(huán)境特點(diǎn)和魚(yú)類多樣性調(diào)查監(jiān)測(cè)的具體要求，展望了 eDNA 技術(shù)在深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性研究中的應(yīng)用前景，旨在為深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性的研究提供更多的科學(xué)參考，并推動(dòng) eDNA 技術(shù)更高效地應(yīng)用于深遠(yuǎn)海的魚(yú)類多樣性研究中，從而服務(wù)于深遠(yuǎn)海環(huán)境下的生物多樣性的保護(hù)與漁業(yè)資源養(yǎng)護(hù)管理。

　　1 eDNA 在魚(yú)類多樣性研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀

　　1.1 單一物種分析

　　基于 eDNA 技術(shù)檢測(cè)珍稀物種、瀕危物種或有商業(yè)價(jià)值的經(jīng)濟(jì)物種的有無(wú)以及對(duì)外來(lái)入侵物種的早期預(yù)警監(jiān)測(cè)是單物種分析中最常見(jiàn)的應(yīng)用方向。珍稀和瀕危物種在生態(tài)系統(tǒng)中的密度較低，用傳統(tǒng)方法監(jiān)測(cè)存在較大的遺漏可能，而通過(guò) eDNA 技術(shù)的單物種分析可精準(zhǔn)檢測(cè)低密度目標(biāo)物種的存在。例如，在日本有一種迄今只收集到 6 尾標(biāo)本的極為罕見(jiàn)的黑頭魚(yú)(Narcetes shonanmaruae)，F(xiàn)UJIWARA 等利用 eDNA 技術(shù)對(duì)該物種進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在已知地點(diǎn) 400km 以外的海山上發(fā)現(xiàn)了該物種的存在。此外，eDNA 技術(shù)因檢測(cè)靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、成本低廉的特點(diǎn)，使其成為了對(duì)外來(lái)入侵物種進(jìn)行預(yù)警監(jiān)測(cè)的理想技術(shù)手段。例如，WANG 等設(shè)計(jì)了一套眼斑擬石首魚(yú)(Sciaenops ocellatus)的引物和探針，對(duì)該入侵物種在東海的分布進(jìn)行研究，該研究方法也為今后入侵物種的監(jiān)測(cè)和評(píng)估提供技術(shù)參考。

　　基于 eDNA 技術(shù)的單物種分析在特定條件下還能實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)生物的豐度和資源量的定量評(píng)估。最早是 FICETOLA 等發(fā)現(xiàn)美國(guó)牛蛙(Rana catesbeiana)密度高的池塘提取的 eDNA 豐度要高于低密度池塘，為利用 eDNA 技術(shù)評(píng)估生物的豐度和資源提供了重要啟示。有學(xué)者利用 eDNA 技術(shù)進(jìn)行漁業(yè)資源研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，物種豐度或生物量與 eDNA 濃度存在正相關(guān)，認(rèn)為可以通過(guò)樣品 eDNA 豐度估算其對(duì)應(yīng)的物種在自然水域中的豐度或生物量。WOOD 等利用 eDNA 技術(shù)對(duì)大西洋鮭(Salmo salar)進(jìn)行檢測(cè)和量化，通過(guò)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和野外實(shí)驗(yàn)的對(duì)比，構(gòu)建了基于 eDNA 檢出率推斷生物量的數(shù)據(jù)模型，表明該技術(shù)在自然環(huán)境下具有監(jiān)測(cè)、定量稀有物種的應(yīng)用潛力。但需要注意的是，此種關(guān)系仍然存在較大的不確定性。例如，JO 等發(fā)現(xiàn)魚(yú)類的資源量、集群和洄游均會(huì)對(duì)其 eDNA 釋放效率產(chǎn)生影響，對(duì) eDNA 的監(jiān)測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾。近期在對(duì)不同水域中的 eDNA 水樣與捕撈的生物量進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn) 3 種目標(biāo)種魚(yú)類的 eDNA 的總拷貝數(shù)和捕獲的總生物量存在正相關(guān)關(guān)系，但是不同自然條件下 eDNA 的衰減率以及 eDNA 豐度與目標(biāo)種密度之間的關(guān)系都可能造成對(duì)目標(biāo)物種生物量的誤判。因此，利用 eDNA 技術(shù)開(kāi)展魚(yú)類豐度和生物量評(píng)估的適用條件還需進(jìn)一步研究，但 eDNA 技術(shù)也確有在特定條件下推斷魚(yú)類種群豐度和生物量的巨大應(yīng)用潛力。

　　eDNA 技術(shù)還能通過(guò)檢測(cè)其豐度在空間和時(shí)間上的變化來(lái)監(jiān)測(cè)魚(yú)類的行為。例如，TAKEUCHI 等應(yīng)用 qPCR 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)的鰻鱺(Anguilla japonica)各生活史階段釋放的 eDNA 濃度，研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵后 eDNA 濃度是產(chǎn)卵前的 10~200 倍，以此輔助檢測(cè)鰻鱺在近海的產(chǎn)卵活動(dòng)。研究人員還應(yīng)用該方法調(diào)查魚(yú)類棲息地的分布、季節(jié)性遷徙和洄游路徑。例如，BYLEMANS 等和 WU 等均發(fā)現(xiàn)通過(guò)監(jiān)測(cè)目標(biāo)物種的細(xì)胞核和線粒體 eDNA 相對(duì)豐度變化可以監(jiān)測(cè)其產(chǎn)卵活動(dòng)，這可能是因?yàn)榇罅康纳臣?xì)胞被釋放到水中，在短時(shí)間內(nèi)顯著改變了水體中核基因和線粒體基因的相對(duì)比例，這一變化也為監(jiān)測(cè)魚(yú)類繁殖活動(dòng)提供了新的方向。THALINGER 等通過(guò)整個(gè)河段的 eDNA 豐度變化構(gòu)建基于 eDNA 的時(shí)間序列豐度模型來(lái)監(jiān)測(cè)魚(yú)類的生殖洄游路線，發(fā)現(xiàn) eDNA 技術(shù)能有效監(jiān)測(cè)水生生物的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。XU 等對(duì)長(zhǎng)江中下游中華鱘(Acipenser sinensis)的洄游路線進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了其季節(jié)性遷徙規(guī)律，證明了利用 eDNA 技術(shù)可以監(jiān)測(cè)中華鱘的分布，從而制定更好的保護(hù)方案。

　　上述研究表明 eDNA 技術(shù)可為調(diào)查魚(yú)類行為提供重要信息，從而為魚(yú)類保護(hù)措施的實(shí)施和漁業(yè)政策的制定提供科學(xué)參考。

　　1.2 多物種群落分析

　　與傳統(tǒng)調(diào)查方式相比，從生態(tài)系統(tǒng)中捕獲的 eDNA，可以不考慮物種的形態(tài)特征、運(yùn)動(dòng)模式或棲息地偏好。基于 eDNA 技術(shù)研究和監(jiān)測(cè)群落水平的生物多樣性一直是該技術(shù)最廣泛的應(yīng)用之一。

　　CHEANG 等基于 eDNA 技術(shù)對(duì)珠江外海河口的魚(yú)類多樣性進(jìn)行調(diào)查，并將結(jié)果與半咸水的珠江河口內(nèi)部的 eDNA 結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)了不同水體對(duì)魚(yú)類分布的影響，也為整個(gè)珠江河口的魚(yú)類群落分布提供數(shù)據(jù)參考;YUKI 等利用 eDNA 技術(shù)對(duì)東京灣水域開(kāi)展為期 3 年的生物多樣性調(diào)查，共計(jì)檢測(cè)出魚(yú)類 177 種，eDNA 技術(shù)以極低的成本提供了大時(shí)空尺度的整體生物多樣性信息;WEST 等利用 eDNA 技術(shù)和水下視覺(jué)普查對(duì)澳大利亞科科斯群島魚(yú)類生物多樣性進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了該水域 46 個(gè)新紀(jì)錄種，eDNA 技術(shù)在珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)下表現(xiàn)出較高的檢測(cè)靈敏度;OKA 等基于 eDNA 技術(shù)對(duì)日本近海的珊瑚礁邊緣和海草床生境中的魚(yú)類多樣性進(jìn)行調(diào)查，共計(jì)檢測(cè)魚(yú)類 291 種，表明 eDNA 技術(shù)能有效輔助漁業(yè)資源的監(jiān)測(cè);MIRIMIN 等結(jié)合 eDNA 技術(shù)和水下視頻數(shù)據(jù)對(duì)東北大西洋魚(yú)類多樣性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，在物種水平上確定了更多魚(yú)類(22 種)，研究表明了 eDNA 技術(shù)在海洋環(huán)境下物種檢測(cè)率高，使用多種手段可以識(shí)別和交叉驗(yàn)證更多的生物類群的存在。eDNA 技術(shù)在海洋生態(tài)環(huán)境下能檢測(cè)出較高的物種豐富度，且與傳統(tǒng)方法相比較，它在調(diào)查效率、投入成本和成本效益等方面的表現(xiàn)更為優(yōu)秀。

　　1.3 群體遺傳分析

　　用傳統(tǒng)方式揭示魚(yú)類自然種群的遺傳多樣性存在一定的挑戰(zhàn)，這主要體現(xiàn)在采樣困難方面，因?yàn)樾枰东@來(lái)自不同地理群體的一定數(shù)量的個(gè)體以保證可靠的遺傳分析。相較而言，使用 eDNA 技術(shù)開(kāi)展遺傳多樣性研究只需要采集研究區(qū)域不同地點(diǎn)的水樣，給采樣環(huán)節(jié)帶來(lái)了極大的便利性，具體原理是檢測(cè)樣品中的同一種群不同個(gè)體的 DNA 序列，通過(guò)個(gè)體間的序列變異進(jìn)行分析，這為魚(yú)類群體遺傳分析提供了非侵入性、經(jīng)濟(jì)和高效的替代方法。

　　在最早的開(kāi)創(chuàng)性研究中，SIGSGAARD 等基于 eDNA 技術(shù)對(duì)鯨鯊(Rhincodont ypus)種群的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明通過(guò) eDNA 獲取的單倍型頻率與基于肌肉樣獲得的單倍型頻率類似，從而證實(shí)了 eDNA 技術(shù)具有評(píng)估種群遺傳多樣性的潛力。此后，TSUJI 等證實(shí)通過(guò) eDNA 技術(shù)獲得香魚(yú)(Plecoglossus altivelis)種群的遺傳多樣性參數(shù)(如核苷酸多樣性)和單倍型，為 eDNA 技術(shù)應(yīng)用于大尺度范圍內(nèi)的種群遺傳多樣性分析奠定了基礎(chǔ)。

　　此外，多項(xiàng)研究進(jìn)一步表明基于 qMiSeq 平臺(tái)等的 eDNA 技術(shù)不但具有分析定量評(píng)估魚(yú)類群落組成的重要應(yīng)用潛力，也能夠揭示不同魚(yú)類的系統(tǒng)地理格局。上述研究的嘗試，證實(shí)了將 eDNA 技術(shù)應(yīng)用于群體遺傳分析不同方向上的重要前景，但這種方法是否適用于不同類群和不同種類的自然群體可能還需要更多的應(yīng)用實(shí)踐來(lái)評(píng)估。

　　2 eDNA 在深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性研究中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

　　2.1 更廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景

　　近十余年里，eDNA 作為生物多樣性監(jiān)測(cè)推斷物種存在的間接遺傳標(biāo)記在國(guó)內(nèi)外的研究中發(fā)展迅速。目前，基于 eDNA 技術(shù)對(duì)魚(yú)類群落的研究已經(jīng)遍布世界各地，這些研究地理覆蓋范圍廣泛，基于 eDNA 技術(shù)研究海洋魚(yú)類群落的文章也不少見(jiàn)，其中包括河口、海灣、近海、珊瑚礁、海草床、深遠(yuǎn)海、極地等。

　　SHELTON 等運(yùn)用 eDNA 技術(shù)對(duì)太平洋開(kāi)闊水域的大頭鱈(Gadus macrocephalus)進(jìn)行定量檢測(cè)，通過(guò)與漁業(yè)聲學(xué)數(shù)據(jù)、拖網(wǎng)數(shù)據(jù)的對(duì)比，證明了 eDNA 技術(shù)在估算豐度和分布的能力及有效性;SALTER 等應(yīng)用 eDNA 技術(shù)對(duì)法羅群島的大西洋鱈(Gadus morhua)進(jìn)行定量調(diào)查，大西洋鱈的 eDNA 檢測(cè)結(jié)果與拖網(wǎng)漁獲物的物種組成高度一致，擴(kuò)大了 eDNA 技術(shù)在重要商業(yè)魚(yú)類種群的區(qū)域生物量評(píng)估中的應(yīng)用范圍。LAROCHE 等基于 eDNA 技術(shù)在深海平原和海山水域進(jìn)行物種檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) eDNA 技術(shù)可以成為評(píng)估海底采礦背景下的生物多樣性的有力調(diào)查工具。

　　此外，有研究證實(shí) eDNA 技術(shù)能夠應(yīng)用于深達(dá) 3000m 的深海海底和中上層魚(yú)類群落進(jìn)行魚(yú)類多樣性檢測(cè)。以上研究表明 eDNA 技術(shù)不但適用范圍廣泛，且可應(yīng)用于深遠(yuǎn)海水域中，對(duì)海域內(nèi)魚(yú)類群落組成和物種分布進(jìn)行調(diào)查和評(píng)估。

　　2.2 更突出的成本效益

　　基于傳統(tǒng)的網(wǎng)具捕撈方法針對(duì)深遠(yuǎn)海水域開(kāi)展魚(yú)類多樣性和漁業(yè)資源調(diào)查和監(jiān)測(cè)，其人力和經(jīng)濟(jì)成本都十分高昂。eDNA 技術(shù)水樣收集容易且能夠減少勞動(dòng)密集型的常規(guī)分類鑒定，在監(jiān)測(cè)成本和效率上均有較為明顯的優(yōu)勢(shì)。VERON 等對(duì)大西洋的魚(yú)類多樣性進(jìn)行研究，通過(guò)比較 eDNA 技術(shù)和拖網(wǎng)兩種調(diào)查方式，研究發(fā)現(xiàn) eDNA 技術(shù)操作雖簡(jiǎn)單，卻能捕獲更多的生物類群和系統(tǒng)發(fā)育豐富度。DIAO 等通過(guò)搭載 “科學(xué)” 號(hào)科考船獲取了福爾摩沙海脊冷泉的 eDNA 海水樣品，對(duì)不同水深的魚(yú)類多樣性進(jìn)行評(píng)估后發(fā)現(xiàn)該海域魚(yú)類的多樣性水平隨深度變化不大。

　　深遠(yuǎn)海的魚(yú)類調(diào)查若僅依靠租用專業(yè)漁業(yè)船只的方式開(kāi)展，經(jīng)濟(jì)、時(shí)間和人力成本將十分高昂，而這些研究從側(cè)面證明，eDNA 技術(shù)通過(guò)搭載其他航次獲取海水等環(huán)境樣品的方式進(jìn)行調(diào)查可以快速、全面獲取同水域內(nèi)不同深度的魚(yú)類分布數(shù)據(jù)，成本效益將十分凸顯。

　　2.3 更高的檢測(cè)靈敏度和更精細(xì)的物種分辨率

　　eDNA 技術(shù)能夠通過(guò)分析單個(gè)水樣來(lái)識(shí)別廣泛的生物類群，可以檢測(cè)到傳統(tǒng)調(diào)查方法較難發(fā)現(xiàn)的隱存種、低密度種群以及珍稀物種，實(shí)現(xiàn)生物物種的高效鑒別以及多生物群落監(jiān)測(cè)。例如，YOSHITAKE 等設(shè)計(jì)特有引物探針檢測(cè)太平洋海域的珍稀物種藍(lán)鰭金槍魚(yú)(Thunnus orientalis)的分布并對(duì)其豐度進(jìn)行估算，表明 eDNA 技術(shù)的檢測(cè)靈敏度高，能對(duì)珍稀物種進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。WESTFALL 等利用 eDNA 技術(shù)研究了西北太平洋海域的生物群落組成，識(shí)別到 12 種已知的外來(lái)物種以及 7 種無(wú)記錄的外來(lái)物種，為外來(lái)物種的早期預(yù)警監(jiān)測(cè)和防控及降低外來(lái)生物入侵的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。其他的相關(guān)研究也證實(shí)這一觀點(diǎn)。FRAIJA-FERNÁNDEZ 等同步使用拖網(wǎng)和 eDNA 技術(shù)對(duì)比斯開(kāi)灣的魚(yú)類多樣性進(jìn)行調(diào)查，相比拖網(wǎng)調(diào)查結(jié)果，eDNA 技術(shù)能在更廣泛的地理和水深尺度上檢測(cè)到更廣泛的多樣性;還能通過(guò) eDNA 技術(shù)對(duì)發(fā)光器小、很難通過(guò)形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定的燈籠魚(yú)實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的物種鑒定。RATCLIFFE 等基于 eDNA 技術(shù)監(jiān)測(cè)產(chǎn)卵區(qū)的魚(yú)類群落，相比形態(tài)學(xué)鑒定，eDNA 技術(shù)在個(gè)體小、可識(shí)別特征少的魚(yú)類早期階段中識(shí)別到種的比例更高，對(duì)物種的分辨率更精細(xì)。MATHON 等基于 eDNA 技術(shù)對(duì)不同海域的珊瑚礁魚(yú)類進(jìn)行研究時(shí)指出目前對(duì)珊瑚礁魚(yú)類了解較為有限，對(duì)一些珊瑚礁魚(yú)類不同階段形態(tài)特征變化尚不明晰，相較于形態(tài)學(xué)鑒定，eDNA 技術(shù)能夠更精準(zhǔn)鑒別珊瑚礁魚(yú)類的種類。

　　總的來(lái)說(shuō)，eDNA 技術(shù)可以為低密度、瀕危物種提供分布與否的數(shù)據(jù)信息，甚至估計(jì)種群大小，為這些物種的保護(hù)和管理提供必不可少的基礎(chǔ)資料。

　　2.4 更低的分類階元偏向性

　　基于捕撈的傳統(tǒng)取樣方法在魚(yú)類種類和大小選擇上存在較大差異，需要根據(jù)特定生境條件對(duì)整個(gè)魚(yú)類群落綜合選取全面有效的取樣方法。與更具選擇性的各類網(wǎng)具相比，基于 eDNA 的檢測(cè)可能是一種更為全面的方法，無(wú)論目標(biāo)生物的形態(tài)特征、運(yùn)動(dòng)模式和棲息地偏好，eDNA 技術(shù)均可從一個(gè)生物群落中的所有物種來(lái)源中無(wú)差別地捕獲目標(biāo)生物類群的 eDNA。例如，VALDIVIA-CARRILLO 等運(yùn)用 eDNA 技術(shù)對(duì)加利福尼亞灣開(kāi)闊水域的魚(yú)類種群進(jìn)行檢測(cè)，與傳統(tǒng)調(diào)查手段相比，eDNA 技術(shù)對(duì)應(yīng)用水體的限制更少、對(duì)物種的選擇性更低，能檢測(cè)到更高的魚(yú)類多樣性。AGLIERI 等研究表明，在所有方法中，與傳統(tǒng)方法相比，eDNA 對(duì)魚(yú)類特征(如體型和攝食行為模式)沒(méi)有選擇性，因此 eDNA 檢測(cè)到的魚(yú)類多樣性最高。一般認(rèn)為，eDNA 技術(shù)與傳統(tǒng)調(diào)查方法相結(jié)合可以實(shí)現(xiàn)更多生物類群的識(shí)別和交叉驗(yàn)證，以降低物種的分類階元偏向性。

　　3 eDNA 在深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性研究中面臨的挑戰(zhàn)

　　3.1 通用引物的擴(kuò)增偏倚性和種屬特異性不足

　　eDNA 分析的操作流程為 eDNA 的獲取、提取分析和鑒定等步驟，其中最影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的環(huán)節(jié)是 DNA 所包含的物種信息的鑒定。eDNA 宏條形碼技術(shù)通常是使用通用引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增并構(gòu)建文庫(kù)，再上機(jī)對(duì)其進(jìn)行高通量測(cè)序。目前，常用到的 PCR 技術(shù)被認(rèn)為具有擴(kuò)增偏倚性，即 PCR 往往會(huì)優(yōu)先擴(kuò)增豐度較高的種類，豐度比例稀少的種類在擴(kuò)增的過(guò)程中會(huì)被忽略，因此 PCR 結(jié)果的 DNA 比例并不直接等同于目標(biāo)生物群體 DNA 序列數(shù)目的比例，從而可能造成誤差。

　　另一方面，eDNA 的鑒定過(guò)程中可能出現(xiàn)因擴(kuò)增引物的種屬特異性不足導(dǎo)致無(wú)法區(qū)隔近緣種。例如，MIN 等在北太平洋沿岸進(jìn)行常規(guī)的 eDNA 監(jiān)測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)常規(guī)的 MiFish 引物無(wú)法區(qū)分平鲉屬(Sebastes)下的各個(gè)種類，需要根據(jù)現(xiàn)有參考序列重新設(shè)計(jì)特異性引物。而根據(jù)不同基因設(shè)計(jì)的引物標(biāo)記甚至同一基因設(shè)計(jì)的不同引物的特異性存在差異，導(dǎo)致檢測(cè)到的生物類群出現(xiàn)變化。例如，LIAO 等采用線粒體 12S rRNA 和 16S RNA 基因的兩種分子標(biāo)記對(duì)南極宇航員海的 eDNA 樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)選擇的兩種標(biāo)記引物在魚(yú)類分類結(jié)果上存在顯著差異，結(jié)果表明，兩個(gè)或多個(gè)標(biāo)記可能比單個(gè)標(biāo)記在魚(yú)類 eDNA 檢測(cè)中具有更好的性能。POLANCO 等選取了線粒體 12S rRNA 基因區(qū)域的 2 對(duì)引物，比較它們對(duì)地中海 eDNA 樣品的魚(yú)類檢測(cè)結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)即使是基于同一基因片段設(shè)計(jì)的引物對(duì) eDNA 樣品的魚(yú)類檢測(cè)結(jié)果存在較大差異，而將兩對(duì)引物結(jié)合使用能增強(qiáng)對(duì)物種的檢測(cè)能力。

　　3.2 假陽(yáng)性和假陰性

　　檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性和假陰性主要是基于研究目標(biāo)區(qū)域的實(shí)際物種 DNA 是否被檢驗(yàn)出來(lái)。假陽(yáng)性結(jié)果可能是在 eDNA 收集和分析的過(guò)程中受到污染，出現(xiàn)了該區(qū)域不可能出現(xiàn)的物種。研究人員需要規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作、對(duì)分析結(jié)果加以區(qū)分和消除以及對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)過(guò)濾。此外，將分析結(jié)果與歷史物種記錄數(shù)據(jù)加以對(duì)照，可以幫助排除假陽(yáng)性結(jié)果;對(duì)于缺乏物種歷史信息的生態(tài)系統(tǒng)還可以通過(guò)同時(shí)空的重復(fù)樣本和重復(fù)實(shí)驗(yàn)以增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

　　假陰性結(jié)果可能由許多因素引起，比如 eDNA 被稀釋而導(dǎo)致無(wú)法檢測(cè)、樣品中的 eDNA 降解、采樣工作和數(shù)據(jù)庫(kù)不足、DNA 條形碼的錯(cuò)誤識(shí)別、引物的標(biāo)記選擇不當(dāng)、過(guò)濾次數(shù)和 PCR 次數(shù)不足等。在深遠(yuǎn)海，需要尤其注意的是，魚(yú)類 eDNA 濃度往往不如近岸海域高，需要加大取樣量和過(guò)濾次數(shù)以便得到更為可信的檢測(cè)結(jié)果，例如，KAWAKAMI 等認(rèn)為在深遠(yuǎn)海環(huán)境下需要多次重復(fù)采樣或過(guò)濾大量的水才能最大限度地檢測(cè)到物種。此外，深遠(yuǎn)海調(diào)查還應(yīng)考慮在深層水體中的垂直分層可能會(huì)導(dǎo)致不同水層之間的 eDNA 存在差異。例如，JEUNEN 等使用 eDNA 技術(shù)在高度層化的海洋站點(diǎn)的不同深度中會(huì)檢測(cè)到不同的魚(yú)類生物多樣性組成，結(jié)果表明采樣深度對(duì)海洋群落組成的檢測(cè)有很大的影響。另一方面，還可從 eDNA 的高效獲取和高質(zhì)量保存等環(huán)節(jié)入手提高 eDNA 的產(chǎn)量以避免假陰性結(jié)果。例如，KAWATO 等通過(guò)改進(jìn) eDNA 提取辦法(將過(guò)濾 eDNA 濾膜切碎放入離心管中裂解)，提高了深海魚(yú)類 eDNA 的獲取量。WU 等通過(guò)比較不同的海水保存方式(RNAlater 或 ATL)，研究其 eDNA 產(chǎn)量提取的效果，研究發(fā)現(xiàn)與常用的 RNAlater 保存方式相比，ATL 溶液在不改變物種組成的情況下能提高 DNA 獲得。

　　3.3 參考數(shù)據(jù)庫(kù)的有效性

　　eDNA 技術(shù)在深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性研究成功運(yùn)用的關(guān)鍵基礎(chǔ)之一在于物種信息的準(zhǔn)確鑒定，而這高度依賴于參考數(shù)據(jù)庫(kù)的完整性和準(zhǔn)確性。然而，目前常用的 GenBank 公共參考數(shù)據(jù)庫(kù)存在許多未經(jīng)校正、種類信息錯(cuò)誤的序列，同時(shí)還存在部分分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的 DNA 片段匱乏甚至缺失等情況，如 12S rRNA 基因的序列片段。例如，F(xiàn)RAIJA-FERNÁNDEZ 等在較淺的站點(diǎn)中通過(guò) eDNA 技術(shù)檢測(cè)到了常見(jiàn)于 50～200 m 深的大西洋水珍魚(yú)(Argentina silus)，作者認(rèn)為其原因可能是大西洋水珍魚(yú)的某種近緣種棲息于淺水層，而參考數(shù)據(jù)庫(kù)中缺少該近緣種的 12S rRNA 基因序列，因此將其誤鑒為大西洋水珍魚(yú)。LIAO 等在南大洋宇航員海的 eDNA 結(jié)果未能覆蓋全部拖網(wǎng)的調(diào)查結(jié)果，這可能與南大洋缺乏全面的調(diào)查導(dǎo)致公共參考數(shù)據(jù)庫(kù)不夠完整有關(guān)。

　　因此，對(duì)種類信息不足的深遠(yuǎn)海開(kāi)展魚(yú)類 eDNA 調(diào)查前，推薦事先構(gòu)建種類覆蓋全面的本地參考庫(kù)。

　　3.4 自然因素的影響

　　eDNA 樣本并不是一個(gè)獨(dú)立的個(gè)體，它與所處的生態(tài)環(huán)境有著不可分割的聯(lián)系，而海洋環(huán)境可能是應(yīng)用 eDNA 技術(shù)最困難且最具挑戰(zhàn)性的水域，這是因?yàn)樗w積和生物量的懸殊比例、洋流和波浪等作用對(duì) eDNA 分散和稀釋的影響，環(huán)境中的溫度、pH、紫外線等因素對(duì) eDNA 保存和提取的影響等。因此，若想更加全面和準(zhǔn)確地研究深遠(yuǎn)海的魚(yú)類多樣性，一些生態(tài)學(xué)方面的問(wèn)題是必須要考慮的。在深遠(yuǎn)海應(yīng)用 eDNA 技術(shù)研究魚(yú)類生物多樣性時(shí)應(yīng)著重注意：(1)了解調(diào)查海域的生態(tài)特征以及其所在區(qū)域的生物群落結(jié)構(gòu)等，以便于更合理地利用 eDNA 技術(shù)研究所在海域的魚(yú)類多樣性;(2)了解 DNA 與環(huán)境之間的交互效應(yīng)，因?yàn)?eDNA 樣本直接與海水接觸，了解 DNA 與環(huán)境之間的交互效應(yīng)能減少結(jié)果和分析的誤差。

　　4 總結(jié)和展望

　　深遠(yuǎn)海作為海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，具有獨(dú)特的生物多樣性，且蘊(yùn)含了豐富的漁業(yè)資源，因此對(duì)深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性開(kāi)展高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)是開(kāi)展?jié)O業(yè)資源利用和管理的重要前提。傳統(tǒng)的捕撈調(diào)查方式應(yīng)用于深遠(yuǎn)海環(huán)境中有一定的局限性，需補(bǔ)充其他更經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確且高效的調(diào)查方式，以完善當(dāng)前深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性調(diào)查和監(jiān)測(cè)方面存在的薄弱環(huán)節(jié)。eDNA 應(yīng)用于單物種分析中，可精準(zhǔn)檢測(cè)珍稀物種、瀕危物種、外來(lái)物種或有商業(yè)價(jià)值的經(jīng)濟(jì)物種的分布，在特定條件下還可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)生物的豐度和生物量的定量評(píng)估，并通過(guò)推斷魚(yú)類棲息地的分布、季節(jié)性遷徙和洄游路徑等方式來(lái)監(jiān)測(cè)魚(yú)類行為;eDNA 應(yīng)用于多物種群落分析中，可揭示目標(biāo)類群的生物多樣性格局，在此基礎(chǔ)上開(kāi)展?jié)O業(yè)資源調(diào)查、外來(lái)入侵物種的早期預(yù)警監(jiān)測(cè)等工作內(nèi)容;除此以外，eDNA 既可實(shí)現(xiàn)定量評(píng)估魚(yú)類群落組成，也具有開(kāi)展群體遺傳分析的重要應(yīng)用潛力。基于 eDNA 在不同場(chǎng)景下的應(yīng)用案例，本文認(rèn)為 eDNA 在深遠(yuǎn)海魚(yú)類多樣性研究中，具有更廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景、更突出的成本效益、更高的監(jiān)測(cè)靈敏度和更精細(xì)的物種分辨率以及更低的分類階元偏向性等關(guān)鍵應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。但需指出，eDNA 技術(shù)在通用引物的擴(kuò)增偏倚性和種屬特異性、假陽(yáng)性和假陰性、參考數(shù)據(jù)庫(kù)的有效性和自然因素影響等問(wèn)題上仍不乏各類實(shí)際挑戰(zhàn)，需要綜合考慮實(shí)際運(yùn)用場(chǎng)景，提前做好規(guī)劃和準(zhǔn)備，并科學(xué)選取研究策略。

　　未來(lái)，eDNA 技術(shù)可以作為傳統(tǒng)調(diào)查方法的重要補(bǔ)充手段，有助于揭示魚(yú)類群落在深遠(yuǎn)海的分布格局、變化趨勢(shì)及其對(duì)全球氣候變化下的響應(yīng)，從而進(jìn)一步支撐深遠(yuǎn)海環(huán)境下的生物多樣性的保護(hù)與漁業(yè)資源養(yǎng)護(hù)管理。在未來(lái)應(yīng)用中，如何與傳統(tǒng)調(diào)查方法有效結(jié)合以及在充分考慮深遠(yuǎn)海獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境特征的前提下將結(jié)果合理轉(zhuǎn)化是值得進(jìn)一步深入探究的問(wèn)題。

李 淵;溫一琳;李 海;劉世剛;妙 星;林龍山,上海海洋大學(xué)海洋生物資源與管理學(xué)院;自然資源部第三海洋研究所;海洋生物多樣性研究室,202405