引言

　　蠶豆(Vicia faba L.)性喜溫暖、涼爽、忌暑熱的氣候，一直是青藏高原的優勢農產品，具有益氣健脾、消除水腫、增強記憶力、健腦等功效。蠶豆田雜草危害，嚴重影響蠶豆的產量和品質 [1-3]。除草劑滅草松(bentazone)具有防效優、殺草譜廣等特點，可有效防除蠶豆田闊葉雜草 [4]。滅草松屬于光系統 Ⅱ 抑制劑，其作用機制是破壞 D1 蛋白，從而阻斷非環式光合電子傳遞鏈，抑制光合作用，導致敏感性植株死亡 [5]。研究發現，高濃度滅草松會對部分蠶豆品種產生藥害 [6]，因此了解滅草松在蠶豆體內的代謝解毒機制有重要意義。

　　植物為抵御逆境脅迫帶來的傷害會增加抗氧化酶和解毒酶活性。例如，水稻和大豆經氯磺隆及胺苯磺隆處理后過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽 S - 轉移酶(GSTs)活性增加 [7];玉米經烯草酮、環磺酮處理后其 POD、超氧化物歧化酶(SOD)活性增加 [8-9];滅草松也可提高水稻抗氧化酶和解毒酶的活性 [10-11]。此外，解毒酶 GSTs 及細胞色素 P450(CYP450)也參與了植物代謝抗性的產生。楊倩等 [12] 研究發現，稗出現抗性種群主要是因為 CYP450、谷胱甘肽轉移酶(GST)介導的代謝增強。Pan 等 [13] 發現，CYP81A6 基因在水稻對除草劑甲磺隆和滅草松的代謝和耐受性中發揮了作用。畢亞玲等 [14] 研究發現，CYP450 家族成員基因 CYP76C1、CYP76C2、CYP76C4、CYP71C6V1、CYP72A31、CYP81A6、CYP81A12 和 CYP81A21 參與了植物對除草劑的代謝解毒作用。目前，植物對除草劑的代謝機理及耐藥機制報道雖然較多，但有關蠶豆對除草劑滅草松的代謝機理及耐藥機制鮮見報道，因此，本研究利用 RNA-Seq 轉錄組分析鑒定蠶豆對滅草松代謝過程中可能涉及到的重要基因，從分子水平研究蠶豆耐滅草松的作用機制，為滅草松耐性機理研究提供蠶豆數據，為耐除草劑蠶豆品種的遺傳育種研究提供理論依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料及藥劑

　　供試蠶豆品種：敏感品種‘小紅蠶豆’(S)和耐藥品種‘VF4’(R)，均由青海省農林科學院提供并經前期試驗篩選所得。

　　供試除草劑：480 g/L 滅草松水劑(bentazon AS，批號 PD20152030)，由巴斯夫公司生產。

　　1.2 耐藥基因挖掘試驗

　　試驗在青海大學溫室中進行(光照 / 黑暗(L/D)：14.5 h/9.5 h;溫度 15~20℃;相對濕度 20%~50%)。采用盆栽試驗 [15]：待蠶豆催芽露白后種入直徑 13 cm、高 13 cm 的花盆中，每盆播種 4 粒，將盆放入不銹鋼方盤中，定時定量澆水。每個品種 30 盆。待蠶豆長至 3~5 葉期噴施 480 g/L 滅草松水劑，施用劑量為有效成分 2160g/hm²。根據前期預試驗結果，確定于藥后 0、3 d 取蠶豆自頂部第 3 片復葉，迅速放入液氮中置于 - 80℃冰箱中保存，備用。各樣品均重復 3 次，試驗 3 次重復，共 12 份樣品，樣品名稱標記為耐藥性品種：R0-1、R0-2、R0-3、R3-1、R3-2、R3-3，敏感性品種：S0-1、S0-2、S0-3、S3-1、S3-2、S3-3。

　　1.3 總 RNA 提取及文庫構建

　　所采樣品送至武漢邁特維爾生物科技有限公司提取 RNA，構建 cDNA 文庫，并對其質量進行檢測。庫檢合格后用 Illumina 平臺進行測序。

　　1.4 轉錄組生物信息學分析

　　過濾原始數據(Raw Reads)，進行測序錯誤率檢查及 GC 含量分布檢查，得到后續分析使用的 Clean Reads。使用 HISAT2 [16] 將 Clean Reads 和參考基因組進行序列比對，獲取在參考基因組或基因上的位置信息，以及測序樣品特有的序列特征信息，利用 StringTie [17] 將序列組裝成轉錄本，通過比較拼接的轉錄本與基因組注釋的結果中提取新轉錄本信息，進行新基因發掘和功能注釋。以 | log₂FoldChange|≥1 且 FDR<0.05 為條件，使用 DESeq2 [18-19] 進行差異基因篩選，分析樣品組間的差異表達。利用 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)、Gene Ontology(GO)進行差異基因功能注釋和富集分析。

　　1.5 實時定量 PCR 分析

　　使用 TRIzol 試劑從蠶豆葉中提取總 RNA，用 FastKing 第一鏈合成試劑盒合成 cDNA。根據轉錄組測序結果所得序列，利用 Primer Premier 5.0 軟件隨機選取 12 個差異表達基因，設計實時熒光定量(qRT-PCR)引物，以 FPKM(每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的 fragments)>50 且 | log₂FoldChange|≥1 為條件，進行差異表達基因篩選。按照 FastReal 快速熒光定量 PCR 預混試劑盒說明配制反應體系，反應程序為預變性，95℃，2 min;變性，95℃，5 s，40 個循環;退火 / 延伸，60℃，32 s。每個樣本 3 次生物學重復和 3 次技術性重復，運用 2^(-△△CT) 進行結果分析。

　　2 結果與分析

　　2.1 測序數據質量評估

　　測序結果表明，Raw Reads 有 46892242~52525260 條，Clean Reads 有 46025006~51412088 條，堿基質量值 Q20 及 Q30 分別大于 98.08%、94.19%，G 和 C 堿基數量之和占總堿基數量的 42.70%~43.14%。將 Clean Reads 與參考基因組進行序列比對，發現能比對上參考基因組的 Reads 有 87.16%~95.22%，惟一比對上參考基因組的 Reads 有 89.05%~90.38%。

　　通過對基因的 FPKM(Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)相關性進行矩陣分析，發現 R0-1~R0-3 與 S0-1~S03、R3-1~R3-3 與 S3-1~S3-3 之間的相關系數均接近于 1，表明這些樣品之間表達模式相似度較高。

　　2.2 差異表達基因篩選

　　每組比較組合的差異表達基因數目。R0 vs S0 組中共篩選到 7813 個差異表達基因，其中 4465 個上調基因，3348 個下調基因;S0 vs S3 組中共篩選到 6387 個差異表達基因，其中 3162 個上調基因，3225 個下調基因;R3 vs S3 組中共篩選到 5967 個差異表達基因，其中 3153 個上調基因，2814 個下調基因;R0 vs R3 組中共篩選到 8977 個差異表達基因，其中 4897 個上調基因，4080 個下調基因。結果表明，R0 vs S0、S0 vs S3、R3 vs S3 及 R0 vs S3 中共同差異表達基因有 512 個。

　　2.3 差異表達基因 GO、KEGG 富集分析

　　對 R0 vs S0、S0 vs S3、R0 vs R3 及 R3 vs S3 中共同的 512 個差異表達基因進行 GO 功能分類，其中生物過程(biological process，BP)涉及 909 個亞類，細胞組成(cellular component，CC)涉及 110 個亞類，分子功能(molecular function，MF)涉及 327 個亞類。取顯著富集前 20 個條目繪制散點圖，其中 7 個條目屬于 BP，1 個條目屬于 CC，12 個條目屬于 MF，說明滅草松對蠶豆生物過程的影響大于對分子功能和細胞組成的影響。

　　進一步對 512 個差異表達基因進行 KEGG 注釋分析，結果表明：在 KEGG 數據庫注釋到 90 條代謝通路，取顯著富集前 20 條代謝通路繪制散點圖，包含異喹啉類生物堿的生物合成、次生代謝產物的生物合成、酪氨酸代謝、黃酮類化合物的生物合成、植物 - 病原菌互作、異黃酮生物合成、過氧化物酶體、二萜生物合成等。

　　2.4 異黃酮生物合成代謝途徑相關基因分析

　　根據 KEGG 數據庫結果，發現許多基因參與了異黃酮生物合成代謝途徑，包括 CYP450 家族基因(CYP71D9、CYP81E8)、丙二酰輔酶 A：花色素 5 - 葡萄糖苷 - 6″-O - 丙二酰基轉移酶(MC5MAT1、MC5MAT2)、異黃酮 3'- 羥化酶(isoflavone 3'-hydroxylase)(IF3H)、羧酸酯酶(carboxlesterase，CXE)(CXE12、CXE6)。經滅草松處理后，上述這些基因表達量水平在耐藥蠶豆內均上調，且高于敏感蠶豆，其中 CYP71D9、CPY81E8、CXE6 在 R3 中表達量分別是 R0 的 3.61、3.63、4.30 倍，CYP71D9、MC5MAT1、MC5MAT2 在耐藥蠶豆中的表達量分別是敏感蠶豆的 1.20、2.87、1.98 倍。

　　2.5 其他代謝途徑相關基因分析

　　對過氧化物酶體、二萜生物合成、谷胱甘肽代謝、次生代謝產物的生物合成 4 個代謝途徑相關基因進行分析，包括過氧化物酶體 2,4 - 二烯酰輔酶 A 還原酶(PODDCR)、過氧化物酶體酰基輔酶 A 氧化酶(PODACAO1)、貝殼杉烯酸氧化酶(KAO2)、CYP450(CYP82G1)、赤霉素 20 氧化酶(GA201-D)、GST(GST23)、GSTs(GSTsF9)、核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(RbcS)、核酮糖 1,5 二磷酸羧化酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase，Rubisco)(Rbc)。經滅草松處理后，PODDCR、KAO2、CYP82G1、GA201-D、GST23、GSTs、GSTsF9 表達量水平在耐藥蠶豆內均上調，其中 CYP82G1、GA201-D 在 R3 中表達量分別是 R0 的 5.44、4.24 倍，在耐藥蠶豆內表達量分別是敏感蠶豆的 2.09、1.65 倍;PODACAO1、RbcS、Rbc 在耐藥蠶豆、敏感蠶豆內表達量下調，在耐藥蠶豆內表達量分別是敏感蠶豆的 1.19、0.74、1.38 倍。

　　2.6 轉錄組 qRT-PCR 驗證

　　為驗證 RNA-Seq 結果的準確性，隨機選取 12 個差異表達基因進行 qRT-PCR 試驗。結果表明：滅草松處理 3 d 后，VFH_I004120、VFH_III198400、VFH_II021000、VFH_I442000、VFH_III064560、VFH_II050640、VFH_IV205840 在耐藥蠶豆及敏感蠶豆中表達量較處理 0 d 均降低，VFH_I346520、VFH_V173200、VFH_II118760、VFH_I073840、VFH_II035080 在耐藥蠶豆及敏感蠶豆中表達量較處理 0 d 均增加，與 RNA-seq 測序結果變化趨勢一致，證明轉錄組測序結果可靠。

　　3 討論

　　通過對不同生長環境和不同發育時期樣本之間的基因差異表達進行對比，可有效揭示特定分子機制 [20]。本研究中，對滅草松處理 0 d 及 3 d 耐藥蠶豆及敏感蠶豆葉片的轉錄組測序結果進行比較分析，發現 R0 vs R3 組的差異表達基因是 S0 vs S3 組的 1.40 倍，與 Liu 等 [21] 研究結果不同，推測可能是因為耐藥蠶豆為抵御滅草松造成的損傷，誘導了更多基因的差異表達。本研究使用韋恩圖分析，獲得了 512 個與蠶豆耐滅草松機制相關的差異表達基因，這些基因均被滅草松誘導表達，且在耐藥蠶豆和敏感蠶豆中的表達存在差異。GO 富集分析結果表明，滅草松對蠶豆的生物過程影響較大。KEGG 富集分析結果表明，這 512 個差異表達基因顯著富集在異黃酮生物合成、過氧化物酶體、二萜生物合成等代謝途徑上，說明蠶豆對滅草松的脅迫做出了應答。

　　異黃酮、花青素等類黃酮化合物廣泛存在于植物的各個組織部位中 [22]，它們能在植物抵御環境脅迫及其他生物之間的互作時發揮重要作用 [23]。異黃酮作為豆科植物生長過程中積累的一類次生代謝產物 [24]，是植保素大豆抗毒素的主要來源，在豆科作物抗脅迫中發揮重要作用 [25]。研究表明 [26-27]，大豆、灰皮黑豆在大豆胞囊線蟲脅迫下可誘導異黃酮關鍵酶表達。花青素酰基轉移酶(包括丙二酰基轉移酶)主要參與多酚類化合物的酰基化結構修飾 [28]，酰基化的花青素可提高穩定性、顯色性及抗氧化活性 [29]。本研究中，經滅草松處理后，IF3H、MC5MAT1、MC5MAT2 基因在耐藥蠶豆、敏感蠶豆中均表達上調，且在耐藥蠶豆內表達量高于敏感蠶豆，推測這 3 個基因參與了蠶豆對滅草松的代謝過程。說明蠶豆在滅草松脅迫下，誘導了類黃酮中異黃酮及花青素相關酶基因表達，這增加了蠶豆抵御除草劑脅迫的能力及抗氧化活性，且耐藥蠶豆內基因表達量高于敏感蠶豆，推測類黃酮在蠶豆耐滅草松機制上起著重要作用。

　　CXE 廣泛存在于動植物及微生物中，可調控除草劑活性、響應植物生物脅迫及活化植物激素信號物質 [30]。在大穗看麥娘 [31] 中發現了一個可以水解芳氧苯氧丙酸酯類活性的 CXE 蛋白(Am GDSH1)，在擬南芥 [32] 中鑒定出一個絲氨酸蛋白酶(At CXE12)，可水解除草劑前體甲基 - 2,4 - 二氯苯氧乙酸。本研究中，經滅草松處理后，耐藥蠶豆內 CXE6 在耐藥蠶豆、敏感蠶豆中表達上調，CXE12 在耐藥蠶豆中表達上調，在敏感蠶豆中表達下調。推測耐藥蠶豆內 CXE6、CXE12 兩個基因參與了代謝過程，對滅草松毒素具有解毒作用;敏感蠶豆內只有 CXE6 參與了代謝過程，而 CXE12 基因受到抑制。

　　在植物的抗氧化系統中，POD 等抗氧化酶能夠相互協調清除植物細胞在逆境(除草劑)脅迫下產生的過量活性氧，維持植株的正常代謝水平，避免受到傷害 [33]。POD 在植物體中負責清除由逆境產生及超氧化物歧化酶作用產生的過量 H₂O₂[34]。本研究中，經滅草松處理后，POD 代謝通路中的 PODDCR 表達上調、且在耐藥蠶豆內表達量高于敏感蠶豆，這與 Matzrafi 等 [35]、趙鉑錘 [36] 研究結果一致。而 PODACAO1 受到抑制表達下調，推測因為 PODDCR 表達上調導致蠶豆對滅草松產生了代謝抗藥性，PODACAO1 與蠶豆耐滅草松機制無關。

　　植物非靶標抗性產生主要是因為除草劑代謝率的提高 [37]，其關鍵酶系包含 CYP450、GSTs，兩者均為多功能重要酶系，可使植物獲得除草劑抗性和選擇性 [38-39]。本研究中，經滅草松處理后，GST23、GSTs、GSTsF9 在耐藥蠶豆中均上調表達，說明這 3 個基因參與了耐藥蠶豆對滅草松的代謝過程，與蠶豆耐滅草松機制有關。CYP71D9、CYP81E8、CYP82G1 及 CYP88A 亞家族基因 KAO2 在耐藥蠶豆、敏感蠶豆中上調表達，且在耐藥蠶豆中表達量高于在敏感蠶豆中的，說明 CYP450 家族基因在蠶豆代謝滅草松過程中發揮了重要作用，參與了蠶豆對除草劑的代謝解毒過程。蠶豆耐滅草松機制與 GSTs(GST23、GSTs、GSTsF9)和 CYP450 酶系(CYP71D9、CPY81E8、CYP82G1 及 KAO2)密切相關。

　　Rubisco 是光合作用碳吸收的主要酶，其活性在調節光合作用中起著重要作用，也是決定凈光合速率最重要的因素 [40]。在高溫 [41]、低溫弱光 [42]、臭氧 [43] 脅迫下，植物體內 Rubisco 活性會受到抑制。本研究中，施用滅草松后，耐藥蠶豆、敏感蠶豆體內 RbcS、Rbc 兩個基因表達均受到抑制，表明滅草松破壞了蠶豆葉片的葉綠體，從而影響了碳吸收。相對于耐藥蠶豆，滅草松對敏感蠶豆中 RbcS、Rbc 的抑制程度更大，猜測滅草松對敏感蠶豆的葉綠體破壞程度大于耐藥蠶豆，這可能是蠶豆表現出敏感的原因。

　　本研究利用 RNA-Seq 技術對滅草松處理后耐藥蠶豆、敏感蠶豆的轉錄組進行測序分析，初步探究了與蠶豆耐滅草松機制可能相關的基因，包括 CYP71D9、CYP81E8、MC5MAT1、MC5MAT2、IF3H、CXE12、CXE6、PODDCR、KAO2、CYP82G1、GA201-D、GST23、GSTs、GSTsF9。本研究結果可為蠶豆對滅草松非靶標抗性機理及蠶豆遺傳育種提供理論基礎。

蔡青;翁華,貴州省銅仁市萬山區魚塘侗族苗族鄉農業農村綜合服務中心;青海大學農林科學院,202501