引言

　　油茶是山茶科山茶屬一類木本食用油料樹種的總稱，是中國特有的木本油料樹種，在中國已有 2300 多年的栽培歷史，是世界四大木本油料作物之一。由油茶種子榨取的茶油是一種富含不飽和脂肪酸、維生素 E 和山茶苷等活性物質(zhì)的優(yōu)質(zhì)食用油，有 “東方橄欖油” 的美稱。除食用和烹調(diào)功能外，茶油及其副產(chǎn)品在日用化工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)上都具有重要的用途，油茶是中國極具特色的經(jīng)濟(jì)林樹種之一。

　　植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可被用來對植物進(jìn)行工廠化快速繁殖，還是生物技術(shù)育種(如基因工程、基因編輯、體細(xì)胞雜交、突變體誘導(dǎo)與篩選、挽救雜種胚、體外授精等)的技術(shù)基礎(chǔ)，因此，研究油茶組織培養(yǎng)有著重要意義。早在 1978 年，廣西林業(yè)科學(xué)研究所生理研究室顏慕勤等對岑溪軟枝油茶進(jìn)行了組織培養(yǎng)并獲得成功。與此同時，其他研究者也對油茶幼胚和未成熟子葉的離體培養(yǎng)以及花藥培養(yǎng)進(jìn)行了探索。最近 Li 等研究了普通油茶愈傷組織誘導(dǎo)、懸浮培養(yǎng)及原生質(zhì)體分離。為了給研究者提供參考，根據(jù)外植體培養(yǎng)類型對油茶組織培養(yǎng)研究進(jìn)展進(jìn)行了論述。

　　1 油茶芽和莖段的組織培養(yǎng)

　　油茶為天然雜合體，通過種子或?qū)嵣绶敝车闹仓瓴灰妆３謨?yōu)良種性。采用油茶芽、莖尖和帶芽莖段進(jìn)行培養(yǎng)，不但無性系繁殖后代保持了母株的優(yōu)良性狀，而且由于存在分生組織，未經(jīng)脫分化階段形成愈傷組織就可以產(chǎn)生叢生芽，從而減少了變異的可能。因此，這類外植體組織培養(yǎng)一般用于油茶種苗快速繁殖。

　　1.1 外植體采集與表面消毒

　　組織培養(yǎng)中的污染和褐變是影響油茶組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，油茶組織培養(yǎng)中外植體污染情況較為復(fù)雜，也較難控制。表面消毒的難易程度受品種、生長地區(qū)、外植體年齡、采集時間等因素影響。最簡單的表面消毒方法是用乙醇和升汞的常規(guī)組合方法。

　　顏慕勤等最早采用岑溪軟枝油茶成年樹的腋芽進(jìn)行培養(yǎng)，在 2—3 月份腋芽剛開始萌動、芽苞剛開始膨脹時采集外植體。采回后剝?nèi)ネ饷鎺讓影?75% 乙醇浸泡 12s，用 0.1% 升汞消毒 12-15min，然后用無菌水沖洗 4-5 次，在無菌條件下剝離腋芽的最后幾層苞片，將腋芽切成 2-3mm 長的小段接種。

　　劉海龍等以 10 月 — 次年 1 月岑溪軟枝油茶帶腋芽莖段為外植體，使用毛刷刷洗后用 75% 乙醇消毒 10-15s，然后用 0.1% 升汞消毒 10-15min，污染率最低(24.5%)，其中用毛刷蘸洗潔精溶液刷洗莖段對莖段滅菌效果影響較大。1 月底 —4 月新萌枝條不帶腋芽莖段較好的滅菌方法為 75% 乙醇消毒 4-7s，0.1% 升汞消毒 5-6min，污染率為 14.3%。

　　陳勝群等取小果油茶當(dāng)年生帶芽莖段作為外植體，用清水沖洗后，在超凈工作臺上用 75% 乙醇消毒 10s，然后用 1.0g/L 的升汞消毒滅菌 10min，無菌水沖洗 5 次。

　　利用乙醇和升汞的常規(guī)組合方法對油茶進(jìn)行消毒的效果一般較差。流水沖洗對降低污染率有重要影響。吳正凱等取飽滿頂芽用流水沖洗干凈后，用中性洗衣粉溶液輕輕刷洗芽苞，再置于水龍頭下用流水沖洗 2-3h，然后用 75% 乙醇快速進(jìn)行表面滅菌，用無菌水沖洗 3-4 次，再用 0.1% 升汞消毒處理 5min，最后用無菌水沖洗 8-10 次。

　　黃莉雅等以油茶品種岑軟 2 號和岑軟 3 號的鮮嫩帶芽的莖段和頂芽為外植體，用流水沖洗干凈后，用中性洗衣粉溶液輕洗，再置于流水下沖洗 2-3h，接著用 75% 乙醇快速滅菌 30s，用無菌水沖洗 3-4 次，然后用 0.1% 升汞消毒 6min，在各處理中這種處理的誘導(dǎo)效果最好，成活率分別達(dá) 71% 和 73%。

　　劉海英取 3—5 月份當(dāng)年生嫩枝，用紗布包裹脫脂棉蘸少許清水輕輕擦洗枝條表面的塵土和絨毛，再用流水沖洗干凈，然后用洗衣粉溶液浸泡 10min 左右(其間不斷攪拌以使清洗均勻徹底)，再用流水洗凈表面洗衣粉溶液并置于流水下沖洗 2-5h，濾干水分后用 75% 的乙醇浸泡約 30s，用無菌水沖洗 3-5 遍，最后用 0.1% 升汞消毒 8min，在各處理中這種處理的腋芽啟動率最高，可達(dá) 64.0%。

　　柯丹萍在用乙醇和升汞組合消毒材料(帶腋芽莖段使用 70% 乙醇浸洗 30s 和 0.1% 升汞消毒 7min 的效果最好)之前，用自來水沖洗后用洗潔精溶液浸洗 15min，然后置于流水下沖洗 2-4h。

　　萬珠珠等在用乙醇和升汞組合消毒材料(帶腋芽莖段使用 75% 乙醇浸洗 8s 和 0.1% 升汞消毒 8min 的效果最好)之前，用自來水沖洗數(shù)次后，在洗衣粉溶液中浸泡 12-20min，再用自來水沖洗 2h。

　　何超銀以當(dāng)年生帶芽莖段為外植體，用刷子輕輕擦洗表面的塵土和絨毛后，用洗潔精溶液浸泡 5min 左右，再用自來水沖洗 30min，用無菌水沖洗 3 次后，用 75% 乙醇處理 30s，用無菌水沖洗 8-10 次后用 0.1% 升汞處理 10min，在各處理中這種處理的效果最好。

　　代忠迪等在 2 次消毒之前，先將枝條外植體在 5℃恒溫箱中低溫處理 8h，再將經(jīng)低溫處理的油茶無性系組培外植體進(jìn)行修剪，在 0.1% 的多菌靈溶液中浸泡 6min，然后用流水沖洗 5h。

　　為了降低污染率，有研究人員采用重復(fù)消毒的方式。李澤等取普通油茶當(dāng)年生半木質(zhì)化莖段作為外植體，用自來水沖洗 20min 左右，再用洗衣粉溶液浸泡 15min，用自來水沖洗干凈后，用 75% 的乙醇浸泡 2 次(每次 30s)，用無菌水沖洗 3-5 遍，然后用 0.1% 的升汞消毒 2 次(第 1 次 10min，第 2 次 5min)，用無菌水沖洗 5 遍，最后用濾紙吸干莖段表面水分。

　　唐國濤等將大棚內(nèi) 2 年生油茶扦插苗嫩枝剪去葉片后，用洗潔精溶液清洗，再用無菌水反復(fù)沖洗后，用 0.05% 升汞溶液消毒 6min，用無菌水沖洗后，再用升汞溶液重復(fù)消毒 1 次。

　　王瑞等將外植體用流水沖洗干凈后，用中性洗衣粉溶液輕洗，將莖段置于流水下沖洗 2-3h，先用 75% 乙醇快速滅菌 10s，然后用無菌水沖洗 3 次，接著用 0.1% 的升汞消毒 2min，用無菌水沖洗 3 次，再用 0.1% 的升汞消毒 3min，最后用無菌水沖洗 5 次。

　　賈效成等也采用了類似的方法，取油茶頂芽或腋芽在流水下沖洗 1h，先用 75% 乙醇快速滅菌 10s，然后用無菌水沖洗 3 次，接著用 0.1% 升汞消毒 2min，用無菌水沖洗 3 次，再用 0.1% 升汞消毒 3min，最后用無菌水沖洗 5 次。

　　代忠迪等采用 2 次消毒來降低污染率：第 1 次消毒時，將帶芽莖段外植體剝?nèi)ネ鈱尤~鞘，用 76% 的乙醇消毒，然后用 0.2% 升汞消毒，再用無菌水漂洗，然后剝?nèi)ブ袑尤~鞘用 0.1% 升汞消毒，再用無菌水漂洗若干次;第 2 次消毒時，用 75% 的乙醇消毒 16s，無菌水沖洗 5 次。

　　在傳統(tǒng)的 “乙醇 + 升汞” 表面消毒方法的基礎(chǔ)上，輔以超聲和低溫冷處理可更好地清除外植體表面雜質(zhì)，并有助于洗脫外植體內(nèi)酚類物質(zhì)，降低污染率和褐化率。具體做法：取油茶樹當(dāng)年萌發(fā)的春梢(1/3-1/2 長度的枝條基部由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚?作為外植體，依次用乙醇和升汞進(jìn)行表面滅菌，然后依次進(jìn)行超聲處理(外植體浸入無菌水中，在 300-500W、10-30℃條件下超聲處理 2-4h)和無菌冷處理(外植體浸入無菌水中，置于 3-5℃冰箱中 4-6d，其間每隔 1d 更換 1 次無菌水)，得到滅菌外植體，再經(jīng)升汞滅菌后，修剪成用于組織培養(yǎng)的外植體莖段。

　　盡管常將乙醇和升汞組合使用進(jìn)行外植體表面消毒處理，但是有少數(shù)研究結(jié)果表明，乙醇和升汞處理對外植體的毒害較強(qiáng)，處理時間不易掌握。而以 2.5% 次氯酸鈉對油茶帶芽莖段和腋芽消毒 20min 的效果最好。

　　為了增強(qiáng)消毒效果，有研究人員采用次氯酸鈉和升汞復(fù)合消毒處理。侯辛辛取當(dāng)年生半硬油茶枝條的頂芽或帶腋芽的莖段作為外植體，先用軟毛刷蘸淡硫磺皂 0.1% 稀釋液刷洗，流水漂洗 10min，用 70% 乙醇浸泡漂洗 45s 后，再用 3 種試劑進(jìn)行組合消毒。結(jié)果表明：單獨(dú)使用 0.1% 升汞和 2% 次氯酸鈉消毒均不能起到滅菌的效果，外植體污染率達(dá)到 100%;采用 2% 次氯酸鈉與 0.1% 升汞復(fù)合消毒的方法后，污染率降至 10% 以下，在此基礎(chǔ)上將 0.4% 多菌靈添加在培養(yǎng)基中，污染率與誘導(dǎo)率均降低，但未達(dá)到顯著水平。2% 次氯酸鈉溶液(消毒 15min)與 0.1% 升汞(消毒 12min)聯(lián)合使用為最適消毒方法。

　　在油茶組織培養(yǎng)過程中，即使進(jìn)行了嚴(yán)格消毒，也會遇到嚴(yán)重的污染問題。因此有研究者使用抗生素、殺菌劑及防腐劑來進(jìn)行抑菌。王瑞等在繼代培養(yǎng)基中分別添加不同種類和質(zhì)量濃度的抗生素和防腐劑，結(jié)果表明添加鏈霉素 20mg/L 的抑菌效果最佳，污染率為 0，增殖系數(shù)為 3.69，其次為青霉素 G 鈉鹽、青霉素 G 鈉鹽 + 四環(huán)素、四環(huán)素，添加多黏菌素 B 的抑菌效果最差，采用苯甲酸鈉、山梨酸鉀作為抑菌劑，污染率均在 92% 以上。

　　張騏飛等試驗(yàn)了多種消毒方法，發(fā)現(xiàn)如下方法效果最佳：取當(dāng)年生半硬枝條在流水下沖洗 10min，用 0.1% 硫磺皂稀釋液浸泡并用軟毛刷蘸刷嫩枝條，用流水漂洗干凈后，剪成帶單個腋芽或頂芽的莖段，先用 75% 乙醇浸泡 45s 后，用 0.1% 升汞處理 12min 和 2% 次氯酸鈉處理 15min 進(jìn)行復(fù)合消毒，然后接種在添加 0.1g/L 的殺菌劑清菌易芽的萌動培養(yǎng)基上。

　　然而在培養(yǎng)基中添加抗生素、殺菌劑及防腐劑來抑菌，可能會影響到外植體的培養(yǎng)。由于野外采集的外植體不易消毒，有研究者取室內(nèi)或溫室內(nèi)萌發(fā)的新芽作為外植體。楊育紅先將明月山紅花油茶多年生硬枝插入盛有濕潤河沙的紙箱內(nèi)，以其新萌發(fā)的側(cè)芽為材料進(jìn)行試驗(yàn)。將芽于流水下沖洗 1h 后，用無菌水浸泡 10min，用 70% 乙醇浸泡 15s 左右，然后用 0.1% 的升汞溶液(加少許吐溫 80)滅菌 4-8min，再用無菌水清洗 4-5 次。

　　唐國濤等將扦插成活且健壯的油茶苗種植在塑料大棚內(nèi)的花盆里，2 月下旬 —3 月中旬取 2 年生扦插苗帶側(cè)芽的嫩枝，剪去葉片后用洗潔精溶液清洗，再用無菌水反復(fù)沖洗，然后切成帶 1-2 個側(cè)芽的莖段，用 0.05% 升汞溶液消毒 6min，用無菌水沖洗后，再用升汞溶液重復(fù)消毒 1 次。

　　龔崢等為了降低污染率，先將植株移栽上盆，待生長穩(wěn)定后移入大棚管護(hù);采集外植體前給植株的地上部分套上透明薄膜袋，每天對全株枝葉噴 1 次多菌靈，連續(xù)噴 7d;剪取枝條后用洗衣粉溶液刷洗枝條表面，用流水沖洗 0.5h，然后浸入 0.025% 的升汞液中 20min，同時用小毛刷仔細(xì)刷洗枝條表面，流水沖洗 0.5h;在超凈工作臺上用 70% 乙醇浸泡 1min，用 0.1% 升汞溶液消毒 6min，用無菌蒸餾水沖洗 6 次。

　　陳春采取預(yù)培養(yǎng)的方式來降低污染率：取油茶優(yōu)良無性系閩 43 的帶腋芽莖段，用自來水沖洗 1-2h，用無菌水沖洗 2 遍，用 70% 乙醇溶液處理 30s 后立刻浸入 0.1% 升汞溶液中消毒 10-12min，或浸入 0.15% 升汞溶液中消毒 8-10min，用無菌水沖洗 5 遍后瀝干，以莖尖為中心，切成 2cm 左右莖段，接種于未添加生長調(diào)節(jié)劑的 MS 培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 20d，確定無菌后轉(zhuǎn)入初代培養(yǎng)基上。經(jīng)這樣處理的外植體的存活率可達(dá) 45% 以上。

　　陳博雯等將在 4—5 月或 9—10 月采集的半木質(zhì)化莖段，用 75% 乙醇消毒 5s 和 0.1% 升汞消毒 10min 后，接種在含有改良 MS 液體培養(yǎng)基的河沙基質(zhì)中，將新萌發(fā)的嫩芽接種至 MS 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 7d，可將未被污染的無菌芽用于下一步的組織培養(yǎng)。采用該方法不僅可降低污染率，還能有效避免褐化，有效萌芽率最高可達(dá) 90.91%。

　　劉虹將去殼油茶種子置于河沙中萌發(fā)，然后取 1 月生實(shí)生苗帶腋芽的莖段來培養(yǎng)。雖然實(shí)生苗容易消毒，但這種組織培養(yǎng)快速繁殖體系本質(zhì)上與實(shí)生苗繁育無差別，即繁殖的植株與親本存在變異。

　　除消毒方法外，采集月份(即使在連續(xù)晴天時采集)可能是影響外植體表面消毒效果的重要因素。通常春季(2—3 月)和秋冬季采摘的腋芽在培養(yǎng)基上容易萌發(fā)，且污染現(xiàn)象不明顯，而夏季采摘的腋芽不易萌發(fā)且易被污染，這可能與外植體的季節(jié)性帶菌情況有關(guān)。

　　王以紅等以 7 齡‘岑軟 3 號’油茶母樹的健壯嫩梢為外植體，研究不同月份采摘的樣本的消毒難易程度，利用 70% 乙醇預(yù)處理 15s 和 0.1% 的升汞消毒(頂芽 6min，莖段芽 15min)，結(jié)果表明無菌活外植體得率不同，2 個高峰期分別為 4 月和 10 月，無菌活外植體得率最低的是 8 月，其次是 7 月。無菌活外植體得率與氣候特點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，因?yàn)楦邷馗邼癍h(huán)境有利于外植體表面的微生物繁殖。

　　張偉寧用與劉海英類似的方法進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在 4—6 月、7—9 月、10—12 月 3 個時間段采集的半木質(zhì)化帶腋芽莖段中，以 4—6 月所采集材料的萌發(fā)效果最佳，用 0.1% 升汞處理 8min 的消毒效果最好，污染率為 7.33%，褐化率為 5.87%，萌發(fā)率為 83.11%。

　　陳博雯等的研究結(jié)果表明，帶腋芽的枝條經(jīng)消毒處理后，秋冬季節(jié)污染率較低，1 月份污染率最低(26.00%)，2 月份起隨著當(dāng)?shù)貧鉁鼗厣蜐穸燃哟螅廴韭手饾u升高，至 4 月份達(dá)最高(66.00%)，8 月份以后逐漸降低。11 月 — 次年 2 月的消毒效果較好。以無木質(zhì)化、半木質(zhì)化、木質(zhì)化莖段為材料，消毒效果差異不大。

　　柯丹萍的研究結(jié)果表明，帶腋芽莖段最佳取材時期為 4—6 月，此時期的材料污染率、褐化率及死亡率均較低，而腋芽萌發(fā)率最高，培養(yǎng) 20d 后達(dá) 75.55%。

　　1.2 外植體和培養(yǎng)物的褐化

　　除污染問題外，由于油茶等山茶科植物中酚類物質(zhì)含量較高，酚類的糖苷化合物是木質(zhì)素、單寧和色素合成的前體，所以在油茶組織培養(yǎng)過程中極易發(fā)生褐變，嚴(yán)重褐變會導(dǎo)致外植體和培養(yǎng)物的死亡。闕生全等經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)油茶外植體褐化程度與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑種類(如 2,4-D、KT 和 NAA)及其濃度、無機(jī)鹽含量等因素有關(guān)。較高的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基中較高濃度的無機(jī)鹽、較高濃度的生長調(diào)節(jié)劑及木質(zhì)化程度高的外植體均會促進(jìn)褐化的發(fā)生，在培養(yǎng)基中加入吸附劑能有效抑制褐化的發(fā)生。

　　吸附劑活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及抗壞血酸(維生素 C)、硫代硫酸鈉(Na2S2O3)和檸檬酸 3 種抗氧化劑對褐化的影響存在差異，以吸附劑的抗褐化效果最好，維生素 C 效果次之，Na2S2O3和檸檬酸效果較差。接種后進(jìn)行暗處理，可在一定程度上減輕褐化反應(yīng)。戴小英等發(fā)現(xiàn)在增殖過程中，以 H 改良培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基可有效防止油茶外植體褐化，比在培養(yǎng)基中添加活性炭的效果好。蔡玲等發(fā)現(xiàn)在岑軟 2 號油茶繼代增殖培養(yǎng)基中添加 20-25mg/L 的維生素 C，能有效減少油茶繼代芽的褐化，褐化率從 73% 降低到 4%。

　　1.3 培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件

　　油茶組織培養(yǎng)快速繁殖研究始于 20 世紀(jì) 70 年代末 —80 年代初。顏慕勤等最早對 10 年生以上的老齡油茶的嫩莖及莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)用 SH 或 H 作基本培養(yǎng)基，并添加不同 NAA 和 BAP 組合，較難培養(yǎng)出愈傷組織，經(jīng) 7-8 周培養(yǎng)，僅 60%-70% 的外植體長出愈傷組織，且無瘤狀物及綠芽出現(xiàn)，但根發(fā)育良好。顏慕勤采用添加有不同種類及濃度植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的改良 ER 固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)在 2—3 月采集的岑溪軟枝油茶成年樹腋芽。30d 后腋芽生長點(diǎn)開始分化叢生小苗，且芽基部能不斷分化叢生苗。此后，關(guān)于油茶組織培養(yǎng)快速繁殖的研究報道持續(xù)出現(xiàn)。以油茶芽和莖段為外植體的組織培養(yǎng)研究大多采用 MS、WPM、H 改良、1/2MS 作為基本培養(yǎng)基，再添加不同類型和不同濃度的細(xì)胞分裂素(6-BA 或 BA、ZT、TDZ)和生長素(NAA、IBA、IAA)，有時會添加 GA₃ 1.0-6.0mg/L 或有機(jī)附加物如水解酪蛋白(CH)500-600mg/L，達(dá)到改善培養(yǎng)效果的目的。

　　目前主要采用頂芽、腋芽和帶芽莖段進(jìn)行油茶組織培養(yǎng)與快速繁殖研究。莖尖分生組織可用于脫除植物病毒和種苗快速繁殖，但由于外植體體積小，培養(yǎng)起來相對較困難，鮮見報道，目前僅見張桂琴等采用改良 1/2MS 培養(yǎng)基對大果紅花油茶芽尖組織進(jìn)行培養(yǎng)的報道。油茶組織培養(yǎng)快速繁殖以芽生芽途徑(如叢生芽途徑)為主，這種方式是以促進(jìn)芽原基上腋芽的不斷提早萌發(fā)來實(shí)現(xiàn)數(shù)量增殖。培養(yǎng)階段主要分為芽誘導(dǎo)或萌發(fā)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)幾個階段，一般不涉及誘導(dǎo)愈傷組織及愈傷組織分化。有研究者以油茶芽和帶芽莖段為外植體來誘導(dǎo)愈傷組織，但一般認(rèn)為利用帶芽的莖段和頂芽為外植體，經(jīng)愈傷組織途徑對油茶快繁的意義有限。不過，在其他外植體難以再生的情況下，或可將該方法與轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合使用。油茶組織培養(yǎng)中較為重要的 2 個階段分別是增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)。實(shí)現(xiàn)苗芽良好增殖是組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)，生根則關(guān)系到得到完整的再生植株及油茶組織培養(yǎng)快速繁殖真正進(jìn)入生產(chǎn)實(shí)踐。

　　在油茶增殖培養(yǎng)研究方面，戴小英等發(fā)現(xiàn)，以 MS、WPM 為基本培養(yǎng)基時，褐化嚴(yán)重，葉片易出現(xiàn)卷曲、脫落，以 H 改良為基本培養(yǎng)基可明顯減少褐化現(xiàn)象，有較多有效芽產(chǎn)生，以 H 改良 + BA 2.0mg/L+IAA 1.0mg/L 的增殖效果為最佳。王瑞等以‘湘林 1 號’組培無菌苗為材料，研究了基本培養(yǎng)基(WPM、MS 和 B5)、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)類型及濃度對油茶組培苗增殖體系的影響，發(fā)現(xiàn)以 WPM+6-BA 5.0mg/L+NAA 0.01mg/L + 生物素 1.0mg/L 為培養(yǎng)基時增殖系數(shù)最高，以 MS+6BA 1.0mg/L+NAA 0.01mg/L + 生物素 0.5mg/L 為培養(yǎng)基時新梢生長效果最好。蔡玲等以‘岑軟 2 號’組培繼代芽為材料，研究了幾種影響油茶組培芽增殖與生長的因素，發(fā)現(xiàn)在繼代培養(yǎng)基(改良 MS+BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L)中添加 CH 200 或 300mg/L，不僅能有效地提高繼代芽增殖系數(shù)，還能促進(jìn)芽生長，縮短培養(yǎng)時間 8-10d。

　　同時添加 20mg/L 維生素 C 能有效減少油茶繼代芽褐化的發(fā)生。油茶組培繼代芽培養(yǎng)最適宜的光照條件是在自然散射光(2000-3000lx)下培養(yǎng) 10d，后期移至 3000-5000lx 光照條件下再培養(yǎng) 20d，每瓶的有效芽可達(dá) 23 株。He 等研究了光質(zhì)對普通油茶不定芽增殖的影響，發(fā)現(xiàn)在紅藍(lán)組合光(4∶1)條件下增殖系數(shù)最高，葉片也最厚。曾艷玲等發(fā)現(xiàn)，在芽誘導(dǎo)階段采用白光(誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 1/2MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.01mg/L)，在增殖、壯苗和生根階段采用紅藍(lán)光(紅、藍(lán)為 4∶1，增殖培養(yǎng)基為 MS+6-BA 1.0-4.0mg/L+IBA 0.01-0.20mg/L，壯苗培養(yǎng)基為 1/2MS+GA₃ 5.0mg/L+IAA 0.01mg/L，生根培養(yǎng)基為 1/2MS)，可促進(jìn)油茶帶芽莖段植株再生。

　　油茶生根培養(yǎng)方面，顏慕勤等最早進(jìn)行了探索，采用不同濃度的吲哚丁酸、吲哚乙酸及萘乙酸等生長素，及固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基、蛭石及濾紙紙橋等培養(yǎng)基進(jìn)行生根試驗(yàn)。在參試的 3 種生長素中，添加 NAA 處理的生根率最高(100%)，其根系粗壯，須根多，出根快，僅培養(yǎng) 7-8d 即開始出根。添加 IBA 處理的生根率明顯低于添加 NAA 處理，添加 IAA 處理中組培苗雖有一定的生根能力，但切口處易生愈傷組織，移栽后愈傷組織易發(fā)黑壞死，影響小苗的成活率。最佳誘導(dǎo)生根的 NAA 質(zhì)量濃度為 8mg/L。

　　在 4 種培養(yǎng)基中，濾紙紙橋培養(yǎng)的生根效果最佳，在瓊脂培養(yǎng)基上組培苗易生愈傷組織，在液體培養(yǎng)基上組培苗不但生根量少，而且多數(shù)植株僅在液面以上部分生根，液面以下部分生根量較少，呈明顯的倒塔形。在其后的研究報道中，大多采用附加較高濃度的生長素(或者同時附加較低濃度的細(xì)胞分裂素)的低鹽基本培養(yǎng)基(如 1/2MS 和 WPM 等)。吳幼媚等采用 1/2MS、1/2WPM、1/2ER 基本培養(yǎng)基對油茶‘岑軟 2 號’無性系組培苗生根培養(yǎng)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明基本培養(yǎng)基是影響油茶組培苗生根的重要因素，其次是培養(yǎng)溫度，植物生長調(diào)節(jié)劑是影響較小的因素。1/2ER 為油茶組織培養(yǎng)最適基本培養(yǎng)基，ABT6 0.5mg/L+IAA 2.0mg/L+NAA 0.8mg/L 為最優(yōu)的生長調(diào)節(jié)劑濃度組合，室溫(28±2)℃、光強(qiáng) 2500-3500lx 有利于油茶組培苗生根。

　　油茶組培苗生根存在較大的難度，采用含 NAA 和 IBA 的常規(guī)生根培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)時，生根苗大多僅 1 條主根，須根較少。唐國濤等以 1/4MS、1/2MS、MS、B5 等基本培養(yǎng)基配以 NAA、IBA、IAA、GA3、2,4-D 進(jìn)行生根試驗(yàn)，經(jīng)過多次多組合試驗(yàn)均未能篩選出適合油茶生根的培養(yǎng)基。龔崢等發(fā)現(xiàn)采用常規(guī)的培養(yǎng)方法無法誘導(dǎo)廣寧紅花油茶植株生根，但采用針對調(diào)節(jié)極性表現(xiàn)的程序系列培養(yǎng)，可促進(jìn)不定根分化，提高生根率，但作者未提供技術(shù)細(xì)節(jié)。譚曉風(fēng)等發(fā)現(xiàn)在 1/2MS+IBA 0.5mg/L 的瓊脂培養(yǎng)基中加入珍珠巖，使油茶根系能夠充分呼吸，大大提高了油茶生根率和移栽成活率。制備方法：配制 1/2MS+IBA 0.5mg/L 瓊脂培養(yǎng)基(瓊脂為 7-10g/L，pH 5.0-5.5)，然后用網(wǎng)兜包好粉碎的珍珠巖，置于融化的培養(yǎng)基中，使珍珠巖充分吸收培養(yǎng)基，稍瀝干后滅菌即可。

　　鑒于在常規(guī)生根培養(yǎng)基上組培苗生根存在困難，研究者多采用兩步法促進(jìn)組培苗生根，即首先在高濃度的生長素培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，然后轉(zhuǎn)接到無任何生長素的培養(yǎng)基上進(jìn)行根的發(fā)育，或者首先用高濃度的生長素溶液浸泡處理苗芽基部，然后進(jìn)行扦插(即瓶外生根法)。范曉明采用 1000mg/L 的 IBA 處理芽苗基部 5s，然后轉(zhuǎn)入 1/2MS 空白培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。陳永忠等此外，為探明油茶組培苗生根機(jī)制，王瑞等研究了油茶組培苗生根過程中生理生化指標(biāo)的變化，陳曉明等采用 1000mg/L 的 IBA 溶液浸泡苗基部 10s，然后接種在 1/4MS+AC200 培養(yǎng)基。張偉寧發(fā)現(xiàn)瓶內(nèi)生根最佳培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA 2.0mg/L + 蔗糖 20g/L，將小苗莖段基部在 1000mg/L 的 NAA 溶液中蘸 20s，然后在 1/2MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的效果最佳。

　　袁德義等發(fā)現(xiàn)試管苗經(jīng) 1g/L 的 IBA 處理 5s 后，轉(zhuǎn)入 1/2MS 空白培養(yǎng)基培養(yǎng)，50d 后生根率高達(dá) 88.3%。陳永忠等采用瓶外生根方法(將生根和移栽步驟合二為一)可提高組培苗的生根率和成活率。具體方法：將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出后，在 0.1% 瑞毒霉 - 錳鋅溶液中浸泡 2-4min 進(jìn)行消毒，之后將組培苗基部在 500-8000mg/L KIBA 溶液中浸泡 3-4s，然后扦插在由黃心土、炭化谷殼灰、細(xì)沙按體積比 1∶2-3∶1 配制而成的基質(zhì)上，最后用透光薄膜封口。劉虹通過對比瓶內(nèi)生根和瓶外生根方法，發(fā)現(xiàn)瓶內(nèi)生根處理的生根率較低，根系脆弱，移栽成活率也較低，瓶外生根(100mg/L NAA 浸泡幼苗 45min 后扦插移栽)處理的生根率較高，且根系粗壯，移栽成活率高。唐國濤等以細(xì)沙作基質(zhì)(將濕潤的細(xì)沙裝入玻璃瓶中，厚度 2.5-3.0cm，然后經(jīng)高壓滅菌處理)，將培養(yǎng) 60d 以上、長 5cm 的木質(zhì)化油茶莖段(切去基部 2cm 以內(nèi)的葉片)基部在 0.1mg/L、深度約 2cm 的 GGR(6 號生根粉)溶液中浸泡 12h，然后進(jìn)行扦插，生根率達(dá) 95%。

　　唐國濤等認(rèn)為油茶組培苗生根較為困難，可能與誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)過程中 6-BA 和外源植物生長調(diào)節(jié)劑在油茶組培苗中的累積有關(guān)，將繼代培養(yǎng)的叢生芽轉(zhuǎn)接到無 6-BA 和外源植物生長調(diào)節(jié)劑的 MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可有效降低 6-BA 和外源植物生長調(diào)節(jié)劑累積效應(yīng)對苗木產(chǎn)生的影響。戴小英等比較了油茶組培苗的根系質(zhì)量及移栽成活率，發(fā)現(xiàn)試管外生根方法更具優(yōu)勢。傳統(tǒng)試管內(nèi)誘導(dǎo)根系需 40d 以上，且生根率和根數(shù)量不理想，而采用高濃度生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行短期誘導(dǎo)(在 1/2H 改良 + NAA 3.0mg/L 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 10d)后，蘸取生長調(diào)節(jié)劑 GGR 200mg/L，直接扦插到黃心土和草木灰(6∶1)基質(zhì)上，30d 后組培苗可在基質(zhì)中產(chǎn)生根系。閆曉芳等采用 1.5-3.0g/L IBA 誘導(dǎo)處理芽苗 3-30min 后，接種到 1/2MS + 多效唑 2-6mg/L 培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，可促進(jìn)油茶組培苗生根。為了繞過油茶組培苗生根困難環(huán)節(jié)，有研究者對增殖芽進(jìn)行壯芽和煉芽后，將其作為接穗，以種子萌發(fā)的胚芽為砧木，進(jìn)行芽苗砧嫁接研究了油茶組培苗生根過程中過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)等的活性變化。

　　2 油茶胚、子葉、葉片等的組織培養(yǎng)

　　采用油茶胚、子葉、葉片等外植體進(jìn)行培養(yǎng)，可以經(jīng)直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生或直接器官發(fā)生途徑實(shí)現(xiàn)植株再生(即不經(jīng)過愈傷組織階段)，也可經(jīng)愈傷組織階段通過間接體細(xì)胞胚胎或間接器官發(fā)生途徑實(shí)現(xiàn)植株再生。特別是間接體細(xì)胞胚胎或器官發(fā)生途徑需要首先誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織，再經(jīng)體細(xì)胞胚胎或器官發(fā)生途徑產(chǎn)生完整植株，最有利于進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯，因此受到許多研究者的重視。此外，采用幼胚培養(yǎng)產(chǎn)生完整植株，可以在遠(yuǎn)緣雜交中挽救雜種胚，對于油茶遠(yuǎn)緣雜交育種具有重要意義。以油茶胚、子葉、葉片為外植體進(jìn)行培養(yǎng)時，大多以 MS 為基本培養(yǎng)基，采用不同比例的細(xì)胞分裂素(6-BA 或 BA、KT、ZT、TDZ)和生長素(NAA、IBA、IAA)組合。與培養(yǎng)芽和帶芽莖段不同，有研究者采用生長素 2,4-D 來誘導(dǎo)胚、子葉、葉片產(chǎn)生愈傷組織。

　　2.1 油茶胚和子葉的組織培養(yǎng)

　　油茶胚和子葉培養(yǎng)有 2 種情況，一種是取成熟胚和子葉進(jìn)行培養(yǎng)，另一種是取未成熟胚和子葉進(jìn)行培養(yǎng)。由于油茶種子十分堅硬，難以從成熟種子中分離胚和子葉，因此，一般先將種子表面消毒后進(jìn)行無菌萌發(fā)，然后取子葉和胚軸進(jìn)行培養(yǎng)。從正在發(fā)育的種子中切割分離未成熟胚(幼胚)和子葉相對容易，因此，通常取幼果或幼嫩種子進(jìn)行表面消毒，然后取胚、子葉和胚軸進(jìn)行培養(yǎng)。與大田植株的葉片相比，合子胚(包括子葉和胚軸)的表面消毒較為容易，而且培養(yǎng)反應(yīng)能力更強(qiáng)，更易培養(yǎng)。但是油茶通常為異株授粉，合子胚來源于母株的有性雜交后代，與母株在遺傳上是異質(zhì)的。

　　顏慕勤首先報道在油茶種子的子葉基部可誘導(dǎo)體細(xì)胞胚狀體發(fā)生。其采用 1-2 月齡無菌實(shí)生苗的節(jié)間及下胚軸作為外植體，可誘導(dǎo)出愈傷組織和小瘤狀物。用 SH 或 H 作為基本培養(yǎng)基，附加 NAA 0.5mg/L 和 BAP 0.5mg/L 最有利于小瘤狀物的產(chǎn)生;再加入 10mL 油茶子葉浸出液可以把瘤狀物的產(chǎn)生率從 1% 增加至 10%。將外植體轉(zhuǎn)移到無任何生長調(diào)節(jié)劑的 SHO 培養(yǎng)基上，會進(jìn)一步長出不定芽及小苗。其后，彭秋發(fā)等采取油茶種子無菌萌發(fā)后的子葉等外植體進(jìn)行培養(yǎng)，林青、Li 等將成熟種子的種仁進(jìn)行表面消毒，然后切取油茶成熟種胚(帶有胚乳組織)接種在 1/2MS 培養(yǎng)基中獲得無菌苗，然后取無菌苗的子葉、下胚軸進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。

　　隆振雄最早對油茶幼胚進(jìn)行培養(yǎng)，將油茶幼果進(jìn)行常規(guī)表面消毒(先用 70% 的乙醇消毒 30s，再放入 0.1% 的升汞中消毒 30min，然后用無菌水反復(fù)沖洗 3-4 次)后，用無菌刀切割并剝出幼果種胚，再割成長 2-3mm 的組織塊接種。隆振雄采用N6、White 和 MS 基本培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明在 White 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)效果良好，其次是 MS 培養(yǎng)基。White+BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L 或 White+2,4-D 0.02mg/L+NAA 0.05mg/L+BA 0.5mg/L 培養(yǎng)基對油茶幼胚愈傷組織及胚狀體的誘導(dǎo)效果較好。在同一誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，油茶幼胚組織的胚狀體誘導(dǎo)率與加入鉬酸銨量呈現(xiàn)正相關(guān)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入 10mg/L 鉬酸銨，誘導(dǎo)率約提高 1.6%。幼胚發(fā)育時期從 3 月油茶幼果開始膨大時起，至 9 月中旬茶果即將成熟時止。在幼胚尚未形成時取樣培養(yǎng)，難以獲得成功;只有在幼胚長 2-3mm 時取樣培養(yǎng)，才能誘導(dǎo)出愈傷組織，并產(chǎn)生胚狀體。油茶幼胚胚狀體的最佳芽分化培養(yǎng)基為N6+IAA 0.5mg/L+BA 2.0mg/L+LH(水解乳蛋白)500mg/L。

　　分化植株的頻率在較大程度上取決于生長調(diào)節(jié)劑種類和比值，如在N6分化培養(yǎng)基中，細(xì)胞分裂素與生長素的比值為 4 的條件下，添加 BA 比添加 KT 的分化效果好，分化植株的頻率高。為了保持優(yōu)良組合的雜交優(yōu)勢并擴(kuò)大再繁殖，盧天玲對油茶未成熟子葉和幼胚進(jìn)行了離體培養(yǎng)，采用附加 2mg/L NAA 和 4mg/L BA 的 MS 基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織，然后轉(zhuǎn)入減少或無生長素及提高細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上分化叢生苗，也可以在再分化培養(yǎng)基上直接誘導(dǎo)叢生苗。生長素 NAA、IAA 對愈傷組織的誘導(dǎo)與分化均有良好效果，BA、ZT、NAA 的適當(dāng)配比是誘導(dǎo)叢生小苗的重要因素。

　　只有綠色或黃綠色的愈傷組織才能分化。培養(yǎng)基含 2,4-D 或 5% 以上的蔗糖均不利于愈傷組織綠化，也不利于分化。6 月之后，油茶種子的胚乳已完全消失，以此時的子葉和幼胚作為外植體較易誘導(dǎo)成苗。韓春霞以六倍體‘華碩’自然授粉后 7—8 月份的幼胚為外植體，發(fā)現(xiàn)在 WPM + 蔗糖 30g/L + 瓊脂 8g/L+NAA 1.5mg/L+6-BA 2.0mg/L 培養(yǎng)基上，幼胚成苗效果最佳。畢方鋮等采用普通油茶優(yōu)良無性系‘湘林 4 號’油茶幼果為材料，進(jìn)行表面消毒后，直接剝?nèi)ネ鈱臃N皮，取出幼胚，將子葉基部切成 0.3~0.5cm3的組織塊接種。此后，范曉明等、胡玉玲等、龐芳芹等、侯辛辛、王江英等采取類似方法對果實(shí)進(jìn)行滅菌，然后取出種子，分離幼胚和子葉進(jìn)行培養(yǎng)。張智俊、張智俊等將油茶未成熟果實(shí)進(jìn)行表面消毒后，剝?nèi)ネ夥N皮，置于無生長調(diào)節(jié)劑的 MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)，然后將子葉切成小塊作為外植體，結(jié)果表明附加適量的 2,4-D 和 KT 有利于胚性愈傷組織的形成，油茶胚狀體起源于單細(xì)胞原胚或者多細(xì)胞團(tuán)，多從表皮細(xì)胞的胚性愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生。

　　2.2 油茶葉片的組織培養(yǎng)

　　與合子胚(包括子葉和胚軸)相比，以在無性繁殖植株上采集的葉片進(jìn)行組織培養(yǎng)，其再生植株理論上與母株在遺傳上是同質(zhì)的，且油茶葉片來源豐富，容易取材。但是葉片隨其生長部位和發(fā)育年齡不同，表達(dá)細(xì)胞全能性的能力是不同的，培養(yǎng)反應(yīng)性比合子胚差，從大田采集的葉片還存在難消毒和容易褐化的問題。為了解決表面消毒難的問題，有研究者取組培苗的葉片或?qū)嵣绲娜~片培養(yǎng)，但后者會帶來遺傳上的異質(zhì)性問題。

　　王瑞等取油茶優(yōu)良無性系‘湘林 1 號’和‘湘林 4 號’當(dāng)年生枝條上完全展開的嫩葉進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn) 2 個品種愈傷組織的萌發(fā)時間以及誘導(dǎo)率差別較大。‘湘林 1 號’以 MS+IBA 0.01mg/L+KT 0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+NAA 2.0mg/L 為培養(yǎng)基最佳，‘湘林 4 號’以 IBA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 2.0mg/L 為培養(yǎng)基最佳，對于‘湘林 4 號’來說，在 4 種基本培養(yǎng)基(MS、WPM、N6、改良 ER4)中，以改良 ER4 為佳。此外，低溫預(yù)處理 5~10d 有助于愈傷組織的誘導(dǎo)，光照條件(暗培養(yǎng)較好)和葉片部位(葉柄較差)均對愈傷組織的誘導(dǎo)有影響。袁德義等通過直接器官發(fā)生途徑使葉片外植體產(chǎn)生不定芽，蔡冬元則以間接器官發(fā)生途徑使外植體產(chǎn)生不定芽。黃武以幼嫩枝條頂端嫩葉為外植體，用 MS + 毒莠定 16mg/L+CuSO42μmol/L 誘導(dǎo)出白色松脆的愈傷組織，用 WPM+NAA 1mg/L+6-BA 1mg/L 誘導(dǎo)出綠色致密的愈傷組織，用 WPM+KT 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L 誘導(dǎo)出結(jié)節(jié)性愈傷組織。對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后，可獲得 4 種類型的愈傷組織。

　　在 MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+ZT 0.5mg/L+TDZ 1mg/L 上可獲得結(jié)構(gòu)松脆的白色愈傷組織，轉(zhuǎn)接到 WPM+NAA 2mg/L+ZT 2mg/L 培養(yǎng)基上 6 周后可形成黃色胚性愈傷組織，再轉(zhuǎn)接到 MS+NAA 0.5mg/L+2,4-D 2mg/L 培養(yǎng)基上 8 周后可分化出體細(xì)胞胚，體細(xì)胞胚在 MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L 培養(yǎng)基上 4 周后可產(chǎn)生綠色子葉。子葉在 MS+6-BA 1mg/L 培養(yǎng)基上可直接分化成芽，將子葉切碎后轉(zhuǎn)接到 MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L 培養(yǎng)基上可脫分化形成愈傷組織;剝離出胚性愈傷和體細(xì)胞胚，在 MS+NAA 0.5mg/L+2,4-D 2mg/L 培養(yǎng)基上繼代增殖，可實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞胚循環(huán)培養(yǎng)。王瑞等以油茶優(yōu)良無性系‘湘林 1 號’的無菌組培苗葉片為外植體，比較分析了蔗糖、果糖、葡萄糖、白糖和麥芽糖 5 種碳源以及不同蔗糖濃度對油茶愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果顯示在碳源中蔗糖(30mg/L)處理的誘導(dǎo)率最高(100%)，以白糖為碳源誘導(dǎo)率達(dá)到 93.3%，其可作為替代碳源。

　　以葉片為外植體進(jìn)行培養(yǎng)時，酚類物質(zhì)會從葉片切口處釋放到周圍的培養(yǎng)基上，導(dǎo)致葉片褐化死亡，愈傷組織的誘導(dǎo)率降低。劉海英發(fā)現(xiàn)低溫預(yù)處理 7d 能較好地抑制葉片愈傷組織褐化，張偉寧、柯丹萍的研究結(jié)果表明消毒后暗培養(yǎng) 7d 能有效抑制褐化現(xiàn)象。黃國文等以油茶葉片為外植體，研究了誘導(dǎo)愈傷組織過程中降低外植體褐化率和提高誘導(dǎo)率的方法，發(fā)現(xiàn)在水中弱光培養(yǎng)枝條 1~2d，0.3g/L 的維生素 C 溶液漂洗外植體 2~3min，在培養(yǎng)基中添加 1.0g/L 活性炭和 0.3g/L 維生素 C 等方法均可以顯著減少外植體的褐化。優(yōu)化的培養(yǎng)基 WPM+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.5mg/L + 蔗糖 15.0g/L + 葡萄糖 15.0g/L + 瓊脂 6.5g/L + 活性炭 1.0g/L + 維生素 C 0.3g/L 可提高外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率，減少外植體褐化。黃武消除越南油茶外植體褐化的辦法是采用在無生長調(diào)節(jié)劑的 MS 基本培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng) 7d，以釋放酚類物質(zhì)，再轉(zhuǎn)移到添加生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)進(jìn)行脫分化。

　　3 油茶花藥的組織培養(yǎng)

　　花藥培養(yǎng)是獲得單倍體植株的有效手段，是植物單倍體育種和倍性操作的重要方法。花藥培養(yǎng)的表面消毒相對容易，采集適宜花粉發(fā)育時期的未開放花苞，經(jīng)低溫預(yù)處理后除去表面幾層花瓣，經(jīng)常規(guī)消毒即可。如隆振雄用 70% 乙醇消毒 0.5min，然后用 0.1% 升汞中滅菌 10min，無菌水漂洗 3~4 次。

　　3.1 適宜的花粉發(fā)育時期

　　隆振雄最早報道對油茶花藥進(jìn)行培養(yǎng)，他發(fā)現(xiàn)在不同花粉發(fā)育時期進(jìn)行取樣，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率存在明顯差異，以四分體期花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高(46.43%)，單核晚期次之(21.67%)，雙核初期花藥則較少產(chǎn)生愈傷組織(4%)。聞麗取大部分小孢子處于單核時期發(fā)育階段的花蕾作為外植體來源，對 8 個油茶物種的花藥進(jìn)行了培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)盛花初期所采樣品的愈傷組織誘導(dǎo)率高于盛花末期所采樣品的誘導(dǎo)率。丁植磊取小孢子發(fā)育處于減數(shù)分裂單核靠邊期的材料，對 12 個油茶物種的花藥進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明在幼壯齡油茶植株背陰面、枝條下部以及始花期采摘花蕾，可獲得較高的油茶愈傷組織誘導(dǎo)率和繼代培養(yǎng)增殖效果。范曉明等以攸縣油茶花藥為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)花粉四分體時期為油茶花藥愈傷組織誘導(dǎo)的最佳時期，取幼壯齡油茶植株背陰面、枝條下部以及始花期花蕾較為適合。侯辛辛認(rèn)為處于單核靠邊期的花藥為誘導(dǎo)油茶胚性愈傷組織的合適外植體(花蕾橫縱長度比在 0.53 左右)。

　　3.2 低溫預(yù)處理

　　對于大多數(shù)植物花藥培養(yǎng)而言，低溫預(yù)處理有助于提高花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率。低溫預(yù)處理同樣可提高油茶花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率。李建安等的小果油茶花藥培養(yǎng)結(jié)果表明，不同低溫(4℃)預(yù)處理時長對愈傷組織誘導(dǎo)率有一定的影響，預(yù)處理 12、6、0d，愈傷組織誘導(dǎo)率分別為 2.99%、2.68% 和 0.83%。說明經(jīng)過一定時間的低溫預(yù)處理可提高小果油茶的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率。聞麗于 10 月上中旬 —1 月下旬摘取普通油茶、小果油茶、攸縣油茶、浙江紅花油茶、廣寧紅花油茶、騰沖紅花油茶、越南油茶、宛田紅花油茶 8 個品種的花蕾作為材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)不同物種、低溫(4℃)預(yù)處理時長，油茶花藥的愈傷組織誘導(dǎo)效果不同。低溫預(yù)處理有利于油茶花藥愈傷組織的誘導(dǎo)，但不同油茶物種最適宜的預(yù)處理時間不同，普通油茶為 10d 左右，攸縣油茶為 5~10d，越南油茶為 15d 左右，浙江紅花油茶為 10d 左右，廣寧紅花油茶為 15d 左右，騰沖紅花油茶為 10d 左右，宛田紅花油茶為 15d，小果油茶花藥經(jīng)過低溫預(yù)處理其誘導(dǎo)率未明顯提高，而普通油茶和小果油茶的花藥愈傷組織誘導(dǎo)效率均達(dá)到了 70% 以上。范曉明等發(fā)現(xiàn)攸縣油茶花藥低溫預(yù)處理時長應(yīng)在 10d 以內(nèi)。

　　3.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

　　隆振雄研究了N6、MS、B5、MB、Miller 和 White 等基本培養(yǎng)基對油茶花藥培養(yǎng)效果的影響，并在培養(yǎng)基中添加了 2,4-D 0.5mg/L、NAA 0.2mg/L、BA 0.2mg/L、KT 1.5mg/L，結(jié)果表明 MB、N

　　6和 White 較為適宜用于油茶花藥培養(yǎng)，誘導(dǎo)率高，而且所誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，呈圓形瘤狀物，乳白色，質(zhì)量較好。以蔗糖為碳源較好。采用器官分化培養(yǎng)基N6+BA 2mg/L+IAA 0.5mg/L+5BR 0.5mg/L + 核黃素 1mg/L + 蔗糖 3% 進(jìn)行分化培養(yǎng)時，愈傷組織僅出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)，未能再生完整植株。進(jìn)行花藥愈傷組織誘導(dǎo)時不加人工光照，但培養(yǎng)室內(nèi)有自然散射光;在進(jìn)行愈傷組織器官分化時，置于 2000lx 光照條件下進(jìn)行，每日補(bǔ)照明 10~12h。

　　李建安等在對小果油茶和廣寧紅花油茶的花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)廣寧紅花油茶花藥具有較強(qiáng)的愈傷組織誘導(dǎo)能力，而小果油茶花藥褐化嚴(yán)重，誘導(dǎo)率較低。在最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 MS+2,4-D 0.6mg/L+NAA 0.4mg/L 和B5+2,4-D 1.2mg/L+6-BA 0.4mg/L 上，廣寧紅花油茶愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá) 94.67% 和 91.00%，小果油茶則分別為 8.00% 和 3.34%。MS 培養(yǎng)基有利于愈傷組織生長增殖。

　　聞麗等在進(jìn)行油茶花藥愈傷組織誘導(dǎo)時，發(fā)現(xiàn)在 MS、B5、N6、Miller 基本培養(yǎng)基中，MS 的誘導(dǎo)效果最好。2,4-D 0.5mg/L 和 6-BA 0.2mg/L 為較佳的生長調(diào)節(jié)劑組合。3%~4% 蔗糖溶液的愈傷組織誘導(dǎo)效果較好。在黑暗條件下培養(yǎng)可以提高油茶花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率。

　　丁植磊等發(fā)現(xiàn)在油茶 12 個物種花藥中，基因型不同，愈傷組織誘導(dǎo)率也不同。以小果油茶、普通油茶、短柱油茶、浙江紅花油茶、茶陵紅花油茶、多齒紅花油茶的愈傷組織誘導(dǎo)率較高(40%~70%)，小果油茶、普通油茶的愈傷組織誘導(dǎo)率甚至高達(dá) 70%。但紅皮糙果油茶、廣西糙果油茶、茶陵紅花油茶、多齒紅花油茶、攸縣油茶的花藥褐化較嚴(yán)重。在繼代培養(yǎng)中 6-BA 和 KT 均有較好的促進(jìn)作用，小果油茶、普通油茶、短柱油茶、浙江紅花油茶、茶陵紅花油茶、多齒紅花油茶的愈傷組織均增殖較好。MS 培養(yǎng)基適合油茶不同物種愈傷組織的誘導(dǎo);在 MS、N6培養(yǎng)基上能獲得較好的愈傷組織繼代增殖效果(均附加蔗糖 35g/L，瓊脂 7g/L，pH 值 5.8)。NAA 0.5mg/L+2,4-D 0.6mg/L 及 6-BA 0.2mg/L+2,4-D 0.5mg/L 適合用于不同物種白花油茶與紅花油茶花藥愈傷組織的誘導(dǎo);MS 培養(yǎng)基附加 NAA 0.5mg/L+ZT 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L 或 6-BA 1.5mg/L+NAA 1.0mg/L 均能獲得較好的愈傷組織增殖效果。添加 0.2%~0.8% 活性炭對于油茶花藥愈傷組織有抑制增殖作用;在愈傷組織繼代培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)中，當(dāng)添加 BA 0.4mg/L、NAA 1.0mg/L 時，活性炭能起到較好的防止褐化和促進(jìn)生長的作用。暗培養(yǎng) 5~10d 改善愈傷組織繼代增殖的效果較好。顏色嫩綠純正、質(zhì)地致密稍硬的愈傷組織的增殖效果最好。繼代時間以 (30±5) d 為宜，繼代 6 次后愈傷組織增殖效果較差。

　　葉思誠等對浙江紅山茶花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn) 2,4-D、KT(6-BA)、TDZ 之間存在協(xié)同作用，通過特定組合能夠更容易誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，提高愈傷組織誘導(dǎo)率。適當(dāng)增加蔗糖的質(zhì)量濃度(30~80g/L)，提高滲透壓，能夠提高愈傷組織的誘導(dǎo)率。此外，CH、LH、脯氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺的添加也可以促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)、體細(xì)胞胚的形成和生長。

　　范曉明等將接種的攸縣油茶花藥置于 (25±3)℃條件下暗培養(yǎng) 25d 后，再移至自控光照培養(yǎng)架上培養(yǎng)，光照時間 12h/d，光照強(qiáng)度 2000lx，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基添加物以AgNO3效果最優(yōu)，誘導(dǎo)率最高為 81.02%，繼代增殖培養(yǎng)基配以 MS+6-BA 2.00mg/L+NAA 0.05mg/L 為最佳。

　　侯辛辛的研究結(jié)果表明適宜海南油茶花藥胚性愈傷組織誘導(dǎo)的初代培養(yǎng)基為改良 MS+2,4-D 2.0mg/L+ZT 2.0mg/L，胚性愈傷組織在 1/2 改良 MS+6-BA 2.0mg/L+ZT 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L 培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)可有效增殖，并分化出體細(xì)胞胚，體細(xì)胞胚在 1/2 改良 MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L 培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)成熟和萌發(fā)形成再生植株，但誘導(dǎo)率較低，培養(yǎng)基配比仍有待進(jìn)一步優(yōu)化。其花藥培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，溫度為 (25±2)℃。在暗培養(yǎng)條件下愈傷組織快速增殖，在光照培養(yǎng)下愈傷組織增殖緩慢，且大部分呈現(xiàn)褐色或壞死狀態(tài)，僅少部分為胚性愈傷組織狀態(tài)。暗培養(yǎng)條件對胚性愈傷組織維持和增殖更有利。5μmol/L + 谷氨酰胺 800mg/L + 絲氨酸 200mg/L，‘華金’‘華碩’‘華鑫’花藥胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率分別是 36.00%、56.33%、8.25%。

　　此外，靳皓然探索了采用油茶未授粉子房和胚珠誘導(dǎo)單倍體，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)子房愈傷組織的最適培養(yǎng)基為 MS + 蔗糖 60g/L + 瓊脂 7g/L+NAA 0.3mg/L+TDZ 2.0mg/L，未授粉胚珠誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基為 MS + 蔗糖 40g/L + 瓊脂 7g/L+NAA 1.0mg/L+TDZ 2.0mg/L。

　　3.4 褐變問題

　　油茶花藥組織培養(yǎng)同樣存在褐變問題，因此，有效控制褐變成為油茶花藥培養(yǎng)的關(guān)鍵。李建安等發(fā)現(xiàn)小果油茶和廣寧紅花油茶的花藥愈傷組織誘導(dǎo)能力差異十分明顯，廣寧紅花油茶花藥愈傷組織容易誘導(dǎo)，而小果油茶誘導(dǎo)困難。小果油茶花藥在接種后第 3 天出現(xiàn)明顯褐化，10d 后所有花藥均呈黑褐色，而廣寧紅花油茶花藥接種后未出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，因此花藥褐化是小果油茶花藥愈傷組織發(fā)生的限制因素。聞麗的研究結(jié)果也表明，不同油茶物種花藥的褐化程度不同。愈傷組織誘導(dǎo)率較高的普通油茶和小果油茶的花藥褐化程度較低，越南油茶花藥褐化程度也相對較低，其次是廣寧紅花油茶、騰沖紅花油茶、宛田紅花油茶、浙江紅花油茶，最高是攸縣油茶。一般褐化情況越嚴(yán)重，愈傷組織誘導(dǎo)率越低。預(yù)處理時長對組織褐化基本上無影響。油茶花藥褐化愈傷組織的組織化學(xué)分析結(jié)果表明：無褐化愈傷組織的細(xì)胞含淀粉、脂滴相對較多，這些物質(zhì)在褐化愈傷組織細(xì)胞的含量相對較少;褐化愈傷組織細(xì)胞中單寧類物質(zhì)、過氧化物酶含量相對較多，而在無褐化愈傷組織細(xì)胞中含量相對較少。

　　4 展望

　　油茶種苗繁育方法包括實(shí)生繁育、扦插繁育、嫁接繁育和組織培養(yǎng)繁育。雖然研究結(jié)果表明經(jīng)組織培養(yǎng)產(chǎn)生的再生植株能夠保持原無性系的優(yōu)良特性，但由于油茶外植體表面消毒困難、褐化嚴(yán)重及生根困難等，還未能實(shí)現(xiàn)利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行工廠化快繁。消毒困難和褐化問題相對容易解決，而生根困難則主要是由于木本植物本身的生理狀態(tài)，外植體培養(yǎng)反應(yīng)性差。在采集外植體時，盡量采集樹體下部的萌條(更接近幼態(tài))，或采取措施促進(jìn)主莖基部萌芽，然后再取主莖基部產(chǎn)生的萌條來培養(yǎng)。

　　由于油茶組織培養(yǎng)和植株再生比較困難，在利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行油茶生物育種方面，目前僅見 Li 等報道普通油茶葉肉原生質(zhì)體分離和 PEG 介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化方法和 Lin 等報道普通油茶花瓣原生質(zhì)體分離和 PEG 介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化方法，尚未見油茶穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法的報道。目前，有關(guān)油茶基因組組裝和測序、重要性狀的關(guān)鍵基因克隆方面的研究取得不少進(jìn)展。未來油茶基因工程與基因編輯的應(yīng)用仍將有賴于油茶組織培養(yǎng)和植株再生技術(shù)的突破，因此應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)油茶組織培養(yǎng)研究。

劉進(jìn)平;胡海燕;吳文嬙;黃小龍;黃東益;王 健;賴杭桂,海南大學(xué);南繁學(xué)院;熱帶油茶海南省工程研究中心;海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院;海南大學(xué)生命健康學(xué)院,202404