引言

　　近年來，人類疾病譜的改變造成心血管疾病治療病患增多及需要血液透析的人群增大，臨床需要實施血管移植的情況越來越多。目前常使用自體血管進行血管移植，其不存在免疫排斥反應，然而患者大多高齡和自身可用于移植的血管數有限，因此限制了這種方法的使用。合成高分子材料如膨體聚四氟乙烯等制成的血管移植物，具有良好的力學性能和生物相容性，已成功應用在大口徑血管移植中。但是合成材料在用于小口徑血管(直徑 1~6 mm)移植時易產生感染、移植物阻塞和血栓形成等問題。組織工程血管移植物(TEVG)在成分和生物力學性能方面已經可以接近天然血管，并證實其植入人體后可被宿主重塑為自體組織。目前最成熟的獲取方法是利用體外血管生物反應器技術，在可降解支架材料上接種血管平滑肌細胞，通過 8 周的三維力學刺激環境培養成以膠原蛋白為主要成分的管狀組織。

　　體外組織工程的培養有 3 個基本要素：種子細胞、支架材料和環境信號。環境信號包括物理條件、離子濃度、細胞因子等，這些通常使用特定的生物反應器和培養基來提供。氧氣濃度是體外細胞培養時一種重要的環境影響因素，盡管已經有多種生物反應器被設計用于 TEVG 的培養，但鮮有關于氧氣濃度選擇的研究。常規培養所用的氧濃度為大氣氧分壓(21%)，然而生理狀態下動脈的血氧分壓在 9.3~13.3 kPa(約 9%~13%)，靜脈的血氧分壓約為 5.3 kPa(約 5%)，遠低于常氧分壓。生理條件下組織的低氧濃度環境，可以為組織工程技術提供參考。已有研究表明低氧可以刺激細胞外基質(ECM)相關蛋白的表達，影響細胞的增殖、分化等功能。血管平滑肌細胞(VSMCs)對于氧氣有特定的響應，在肺動脈高壓中缺氧會引起肺動脈平滑肌細胞過度增殖和遷移，并促進膠原蛋白沉積和交聯增強，導致血管壁增厚。這為新型組織工程血管的發展提供了新的路徑。

　　膠原蛋白是 ECM 的主要成分，在組織中起到提供結構支撐和拉伸強度的作用，并且調節細胞的粘附和遷移。膠原蛋白的種類和含量直接影響了各種間充質組織(例如血管壁)的力學強度。在血管壁中，最主要的膠原類型是 Ⅰ 型膠原蛋白(ColⅠ)和 Ⅲ 型膠原蛋白(ColⅢ)，而理想的 TEVG 也需要有足夠的高質量 Ⅰ 型和 Ⅲ 型交聯膠原纖維以支持拉伸、縫合和搏動等力學行為，從而在血管移植后順利發揮作用。因此研究 ColⅠ 和 ColⅢ 的分泌和膠原纖維的形成對于 TEVG 的構建具有十分重要的意義。

　　本研究擬采用不同氧氣濃度培養 VSMCs，通過評估增殖活性來確定細胞培養的最優氧氣濃度;分析常規氧濃度和低氧濃度下膠原蛋白的分泌情況以及沉積在細胞層中的膠原含量;在聚乙醇酸(PGA)支架上開展 TEVG 三維培養，探討低氧條件下的三維培養效果，以期進一步獲得一種新型小口徑組織工程血管培養技術。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要試劑和儀器

　　杜氏改良 Eagle 培養基 / F12(DMEM/F12)培養基和胎牛血清(FBS)購自 Corning 公司;無紡布聚乙醇酸(PGA)購自 Biofelt 公司;CCK8 細胞活性檢測試劑盒購自 Dojindo 公司;羥脯氨酸檢測試劑盒購自 Solarbio 公司;RNA 提取試劑盒購自 Beyotime 公司;逆轉錄試劑盒和 SYBR Green 染料法 qPCR 試劑盒購自 Yeason 公司;上樣緩沖液和抗氧化劑購自 Invitrogen 公司;4% 多聚甲醛購自 Leagene 公司;兔多克隆 ColⅠ 抗體購自 Proteintech 公司;兔多克隆 ColⅢ 抗體購自 Abcam 公司;羊抗兔 HRP 偶聯二抗購自 Abbkine 公司。

　　1.2 細胞獲取和培養

　　血管平滑肌細胞取自新生小牛的胸主動脈，分離血管壁獲得血管中膜組織后用組織塊培養法得到原代 VSMCs，后續實驗所用的細胞代數為 P2-P5 代。使用含 15% FBS 的 DMEM/F12 培養基培養細胞。常氧組的細胞在含(體積分數)CO₂的普通 CO₂培養箱中培養;低氧組的細胞則在可設置不同氧氣含量的三氣培養箱中培養，其他條件與常氧組一致。

　　1.3 TEVG的培養

　　選用無紡布的 PGA，裁剪縫合成管狀后作為三維支架材料。用 1 mol/L NaOH 堿化處理 PGA，再用無菌水清洗 3 遍。隨后用 95% 乙醇浸泡消毒，風干待用。將以 7×10⁶個 /cm 的細胞密度接種于 PGA 上，完成接種后靜置于 37℃的 CO₂培養箱 3h 等待細胞貼壁，然后加入適量培養基進行培養，每 3d 更換一次培養基。對照組在普通的 CO₂培養箱中培養 30 d，低氧處理組在 7% 氧氣的三氣培養箱中培養 15 d 后轉移到常氧繼續培養 15 d。

　　1.4 細胞活性增殖檢測

　　采用 CCK8 試劑盒檢測細胞活性，不同天數下細胞活性的變化反映了細胞的增殖速率。在 96 孔板中接種 VSMCs，分別在常氧、2%、5%、7%、10%(體積分數，下同)氧氣條件下進行培養，每組設置 5 個復孔。在每個檢測時間點去除培養基，用 CCK8 試劑與生長培養基按體積比 1∶10 混合后加入每個孔中，置于 CO₂培養箱或三氣培養箱中孵育 3 h。孵育結束后，用酶標儀檢測在 450 nm 處的吸光度。分別檢測培養 0、1、3、5、7 d 的細胞活力。

　　1.5 總膠原含量的檢測

　　羥脯氨酸是膠原蛋白中的一個主要成分，其含量與膠原蛋白的總量成正比，通過測定樣品中羥脯氨酸的含量，可以間接推算出膠原蛋白的總量，因此總膠原含量用樣品中含有的羥脯氨酸含量表示。使用羥脯氨酸(HYP)含量檢測試劑盒檢測樣品中的羥脯氨酸含量。培養完成后的細胞層或組織用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后用 6 mol/L 的 HCl 溶液在 110 ℃下消化 16 h，待冷卻后用 10 mol/L 的 NaOH 溶液調節 pH 至中性，即為消化液。將待測的消化液或羥脯氨酸標準品按試劑盒說明處理后在酶標儀下檢測 560 nm 的讀數，計算出羥脯氨酸的含量。細胞培養基則加入等體積的 12 mol/L HCl 溶液，在 110 ℃下消化 16 h，隨后按同樣步驟檢測溶液中的羥脯氨酸含量。

　　1.6 qPCR分析膠原基因表達

　　細胞分別在常氧和 7% 氧氣條件下培養 3 d 后，使用 RNA 提取試劑盒提取細胞總 RNA，再用逆轉錄試劑盒將 RNA 逆轉錄為 cDNA。然后使用 SYBR Green 染料法 qPCR 試劑盒檢測膠原基因 mRNA 的 Ct 值。所有基因的值以 β-actin 作為內參進行歸一化，使用 2^-ΔΔCt 方法計算相對表達定量。

　　1.7 蛋白免疫印跡

　　在每次更換培養基前取樣細胞培養基，取等量培養基樣品分別加入上樣緩沖液和抗氧化劑在 97 ℃變性 10 min 之后，在 4%~12% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上進行凝膠電泳。然后將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用 ColⅠ 和 ColⅢ 一抗和對應的偶聯二抗進行免疫印跡顯色。

　　1.8 組織學染色

　　培養的血管組織用 PBS 沖洗兩次，用 4% 多聚甲醛固定 24 h。然后用酒精進行逐級脫水，再用二甲苯處理后包埋在石蠟中。獲得 5 μm 厚的切片用于 Masson 染色，以及 ColⅠ 和 ColⅢ 免疫熒光染色。

　　1.9 數據分析

　　采用 GraphPad Prism 9.0 分析數據及繪制統計圖。兩組間差異的顯著性用非配對 t 檢驗來確定，多組數據的比較采用雙因素方差分析。結果以 “均值 ± 標準差” 表示，P 值小于認為具有顯著性差異。顯著性水平設定為 P 值 < 0.05(*P 值 < 0.05，**P 值 < 0.01，****P 值 < 0.001，****P 值 < 0.0001>。

　　2 結果

　　2.1 血管平滑肌細胞活性增殖

　　在不同氧氣含量下培養 7 d 的 CCK8。除了在第 5 天的 2% 氧氣條件下細胞活力低于常氧對照，其他條件下的低氧培養的細胞活力均高于常氧。從細胞活力增長曲線上看，在 7% 氧氣條件下的細胞活力增長最快，顯示出最強的增殖活力。5% 和 10% 氧氣時顯示出相近的活力增長。而 2% 氧氣條件下的細胞在第 3 天時細胞活力高于其他組，然而在第 5 天時卻低于其他組。因此，選用 7% 氧氣進行后續實驗。

　　2.2 培養基中的總膠原含量

　　不同時間點培養基中所含的羥脯氨酸含量結果。7% 氧氣培養的細胞在第 5、7 和 9 天的培養基液中膠原含量顯著高于常氧組，而在其他時間點無顯著差異。另外，無論是 7% 氧氣還是常氧，培養基中的膠原含量在第 9 天時達到峰值。

　　2.3 膠原基因的相對表達

　　qPCR 結果顯示與常氧相比，VSMCs 在 7% 氧氣條件下 ColⅠ 和 ColⅢ 基因的表達顯著上調，分別為 1.20 倍(P=0.0080)和 1.34 倍(P=0.0015)。

　　2.4 分泌到培養基中的 Ⅰ 型膠原蛋白和 Ⅲ 型膠原蛋白的含量

　　對條帶進行灰度值分析的結果顯示，與常氧條件相比，7% 氧氣條件下的培養基中的 ColⅠ 含量在不同時間點均無顯著差異。另外，在第 3 和 5 天時兩組均無法檢測到培養基的 ColⅢ，而在之后的第 7—11 天里 ColⅢ 水平逐漸上升，并且 7% 氧氣組培養基的 ColⅢ 水平顯著高于常氧組。

　　2.5 細胞層沉積的膠原蛋白含量

　　將培養 11 d 后形成的細胞層刮取下來進行羥脯氨酸含量檢測，結果顯示，7% 氧氣培養下形成的總細胞層中膠原的含量為(2.585±0.042)μg / 孔，顯著高于常氧下的含量(0.836±0.024)μg / 孔(P<0.0001)，增加到了 3.1 倍。

　　2.6 PGA 支架上的 TEVG 培養

　　組織切片的 Masson 染色結果顯示，常氧條件下的 TEVG 構建體僅在外表面有較多膠原纖維分布，而 7% 氧氣處理組管腔內外表面均有較多的膠原纖維分布，并且含有更為豐富的膠原纖維。分別對 ColⅠ 和 ColⅢ 進行免疫熒光染色拍照。結果顯示，7% O₂組的中和廣泛且密集地分布在組織中，僅有一些由未完全降解的 PGA 纖維絲占據的小空隙存在。這些 PGA 碎片也能在 Masson 染色中觀察到。而常氧條件下的構建體內部 ColⅠ 和 ColⅢ 分布相對稀疏，仍有較多空隙未被膠原填充。羥脯氨酸檢測結果顯示，7% O₂組的中含有的總膠原含量((3.080±0.850)mg/g)顯著高于常氧組((1.478±0.124)mg/g)，增加到了 2.09 倍(P=0.0319)。

　　3 討論

　　本研究觀察不同氧氣含量對細胞活性的影響結果發現，在 7% 氧氣含量下細胞的活性增速最快，反映其對細胞增殖速度的提升。文獻 [19-20] 的結果表明，在低氧環境下細胞可以通過 HIF-1α 介導的信號通路上調增殖和代謝相關的基因表達。本研究結果也顯示，7% 氧氣條件下，血管平滑肌細胞代謝和增殖活性明顯提高。雖然不同程度的低氧在早期都促進了細胞活性的增長，但是長時間的過低氧氣含量似乎影響了細胞活性的增長。本研究中發現，2% 氧氣含量下在第 5 天時細胞活力反而低于常氧對照組。在一些其他人的研究中使用缺氧(1%)條件后細胞活性受到損害 [21-22];這表明一定范圍內的低氧含量有利于提高細胞活性，過高或過低可能會起到反作用。基于這些結果，本研究選擇了 7% 的氧含量作為后續的低氧實驗條件。

　　本研究觀察到低氧環境下第 5—9 天細胞培養基中膠原蛋白含量有了顯著增加。另外，在第 11 天時培養基中的膠原蛋白含量出現下降。這可能與膠原蛋白在細胞外的組裝和交聯速率有關，有證據表明膠原蛋白濃度會受膠原交聯程度的影響 [23]。

　　從基因的表達來看，低氧環境下 ColⅠ 和 ColⅢ 的 mRNA 水平有所上調，盡管上調的程度不高(約 1.2~1.3 倍)。文獻 [24-25] 的結果表明，膠原合成具有復雜的翻譯后處理過程，因此 mRNA 水平的變化可能無法完全反映膠原蛋白水平的變化。而從分泌的蛋白來看，常氧和低氧組的培養基中 ColⅠ 蛋白含量沒有顯著性的差異，盡管在第 3 天時低氧組略高于常氧。此外，在前 5 d 培養基中幾乎沒有 ColⅢ 蛋白，并且從第 7 天起在低氧組的細胞培養基中 ColⅢ 的增加更為明顯，這表明培養基中的膠原蛋白的增加可能主要與 ColⅢ 的釋放有關。

　　文獻 [17,26-27] 的結果表明，ColⅢ 主要存在于動脈壁的中層中，沉積在 ColⅠ 纖維的外圍區域，被認為在調節 ColⅠ 纖維生成中發揮作用。越來越多的研究發現，ColⅠ 主要影響膠原網絡的強度，而 ColⅢ 影響膠原網絡的彈性。因此，ColⅢ 和 ColⅠ 的比例會影響血管的彈性和適應性重塑能力 [26,28]。此外，在 ColⅠ 和 ColⅢ 的共組裝中，當增加 ColⅢ 的比例時，原膠原纖維的成核速率會增加，并且可以調節原膠原纖維的直徑 [26,29-30]，因此猜測 VSMCs 響應了低氧而增加 ColⅢ 的分泌可能促進更多的原膠原纖維形成。

　　培養基中的膠原蛋白會進一步組裝、交聯形成不溶性的膠原纖維，成為細胞外基質的主要組成部分 [24]。本研究發現低氧下膠原分泌的增加確實導致了形成的細胞層 ECM 中膠原蛋白含量的顯著增加。利用管狀 PGA 支架進行 TEVG 的三維培養，結果發現經過低氧處理 15 d 的 TEVG 膠原生成量增多。與之對應的，是從橫截面切片中觀察到低氧形成更多的膠原纖維，并且無論在材料表面還是在內部，膠原的分布都更為密集和均勻。這一結果這表明，低氧通過促進膠原的生成和沉積可以加快在三維材料上膠原纖維的形成，產生更多的細胞外基質。以上結果進一步表明，在培養過程使用低氧含量有利于生成更優質的 TEVG，未來具有很好的應用推廣前景。

　　4 結語

　　該研究通過營造不同低氧環境處理 VSMCs，發現低氧可以促進 VSMCs 的增殖活性，并且在 7% 氧氣條件下活性最高。以 7% 氧氣作為最佳條件做進一步的檢測發現，低氧上調了膠原基因的表達，并促進膠原蛋白的分泌，尤其是 ColⅢ;低氧還使第 11 天時細胞層 ECM 中總膠原蛋白的含量增加到了 3.1 倍。使用三維支架材料 PGA 接種 VSMCs 培養 TEVG，發現低氧同樣增加了 PGA 上沉積的總膠原含量(2.09 倍)，并形成更致密的膠原纖維，從而有利于 TEVG 的構建。這一結果可為選擇合適的培養環境條件提供依據，從而為進一步優化 TEVG 的設計和制備提供參考。

林展翼;肖聰;許健宜;劉青;孫盱衡;方麗君,華南理工大學醫學院;廣東省人民醫院;季華實驗室,202501