1 實驗部分

　　1.1 實驗原料

　　本研究使用的 ZG154 和 ZG187 抗體屬于 IgG1 類，由上海臻格生物技術有限公司提供，樣品通過標準色譜過程進行純化，在 40℃的培養箱中避光放置。實驗中所用的氯化鈉、二水合磷酸二氫鈉等試劑，分別來自國藥集團化學試劑有限公司、美國 Sigma-aldrich 公司、普洛麥格生物技術有限公司、美國賽默飛世爾科技公司等，所有試劑均為分析純，未經純化直接使用。

　　1.2 實驗方法

　　SEC 測定分子大小變異體純度：采用 Agilent 1260 型液相色譜儀進行分析，對樣品的稀釋濃度、進樣體積、使用的色譜柱、流動相組成、流速、洗脫時間、柱溫箱溫度以及紫外檢測波長等都進行了明確的設定。

　　AUC 測定分子大小變異體純度：對樣品 ZG154 和 ZG187(質量濃度 2mg/mL)進行 SV 分析，包括在 20℃下平衡時間、使用的轉子和離心機型號、離心條件、掃描參數以及數據分析所用軟件、分布模型、分析置信水平等，同時還設定了不同樣品的溶劑密度、黏度以及 SEC 流動相的密度和黏度。

　　蛋白質 PTMs 測定方法：取樣品進行一系列處理，包括加入變性緩沖液、DTT，水浴反應后進行烷基化，再脫鹽處理，加入 Trypsin 酶反應，最后終止反應上樣分析，采用 Q-Exactive 型液質聯用儀，對儀器的離子源、質量分析器、色譜柱、流動相以及洗脫模式、分析模式和數據分析軟件等進行了詳細說明。

　　蛋白質二級與三級結構測定方法：采用 ChirascanTM VX 型圓二色光譜儀在室溫下測定樣品圓二色性，對樣品稀釋濃度、比色皿規格、光譜測量范圍、步進、采樣時間以及結果處理方式都進行了規定。

　　蛋白質熔融溫度檢測方法：采用 Prometheus NT.Plex DSF 型蛋白穩定性分析儀測定樣品熔解溫度，對毛細管吸取樣品的要求、熒光激發強度調節、起始和終止溫度、加熱速率以及確定蛋白質熔解溫度的方式進行了說明。

　　蛋白質擴散相互作用系數檢測方法：將樣品稀釋到不同濃度，離心后加入 384 孔板，使用 Plate Reader Ⅲ 型高通量動態光散射儀測定擴散系數，規定了測定時的溫度、激光功率、測量時間、平行測定次數以及計算擴散相互作用系數的公式。

　　2 結果與討論

　　2.1 SEC 分析樣品聚集與斷裂行為

　　40℃時，ZG154 樣品中高分子量物質(HMW)隨放置時間延長明顯增加，聚體和低分子量物質(LMW)含量也逐漸增加，其聚集與斷裂行為同時發生;ZG187 樣品在 40℃放置一個月后，HMW 含量變化可忽略不計，但 LMW 含量從 0.2% 增加到 2.1%，表明只發生斷裂行為。這體現出兩種 mAbs 對 40℃環境反應存在差異，后續需 AUC-SV 進一步分析。

　　2.2 AUC-SV 分析樣品的聚集與斷裂行為

　　相較于 SEC，AUC-SV 更有助于表征樣品原生狀態。ZG154 樣品在 40℃放置時聚體含量明顯增加，二聚體沉降系數逐漸降低;ZG187 樣品在 40℃下放置一個月后，聚體含量幾乎不變，但在 SEC 流動相中測試時，沉降系數分布顯著變寬且出現碎片峰，這是因為 SEC 流動相高鹽濃度影響了蛋白構象和碎片間非共價相互作用。此外，AUC-SV 測量的聚體含量超過 SEC 法測定結果，是由于 SEC 分析時流動相使樣品稀釋導致聚體解離。

　　2.3 蛋白翻譯后修飾變化

　　蛋白質的 PTMs 變化是導致其聚集和斷裂行為的重要因素。40℃放置 1 個月后，ZG154 分子重鏈 Asn 329 位點脫酰胺修飾比例增加較少，進行 2 個月加速穩定性實驗后，該位點脫酰胺修飾比例增加了 30.7%，同時還有其他位點發生脫酰胺或異構化修飾。脫酰胺會引起蛋白質疏水性變化，易引發聚集和斷裂。ZG187 樣品在 40℃放置一個月后，HC 上 Met 430 位點氧化修飾比例增加了 36.9%，還有少量其他位點氧化修飾，Met 氧化會影響 mAbs 構象穩定性，對聚集與斷裂有顯著影響。

　　2.4 不同修飾對蛋白二級與三級結構的影響

　　蛋白質二級與三級結構變化可能導致疏水區域暴露，引發聚集。CD 分析表明，40℃條件下放置前后的 ZG154 和 ZG187 樣品的 CD 圖譜沒有明顯變化，說明 ZG154 分子 Asn 329 位點的脫酰胺修飾和 ZG187 分子 Met 430 位點發生的氧化修飾沒有導致分子二級和三級結構的變化，且二者的 N 糖基化修飾在 40℃放置過程中基本不變，表明其聚集與斷裂行為不是由蛋白二級和三級結構變化引起的。

　　2.5 不同修飾對蛋白穩定性的影響

　　Tm 是衡量蛋白質熱穩定性的重要指標，脫酰胺和氧化修飾可能破壞蛋白質折疊穩定性。40℃放置后，ZG154 分子各個結構域 Tm 值基本不變，表明其聚集和斷裂行為不取決于結構域穩定性變化，而是與琥珀酰亞胺形成有關;ZG187 分子的 Tml 顯著下降，說明 Met 430 位點氧化修飾降低了其單個結構域穩定性，導致斷裂行為發生。

　　2.6 不同修飾對蛋白分子間相互作用的影響

　　kD 用于描述溶液中溶質分子間相互作用力，蛋白質聚集與分子間相互吸引有關。ZG154 樣品的 kD 值為負，說明分子間存在相互吸引作用，40℃放置時聚集行為與之相關，且 Asn 329 位點脫酰胺修飾增加了分子間相互吸引作用，加速聚集并使二聚體沉降系數變小;ZG187 分子的 kD 值為正，且 Met 430 位點氧化修飾后仍為正值，表明分子間總是相互排斥，所以未發生聚集行為。

　　3 結論

　　ZG154 分子 HC 上 Asn 329 位點脫酰胺修飾比例增加 30.7%，加速分子聚集并導致斷裂;ZG187 分子 HC 上 Met 430 位點氧化修飾比例增加 36.9%，導致分子單個結構域穩定性下降而發生斷裂，但分子間始終相互排斥未發生聚集。該研究為 ZG154 和 ZG187 抗體的進一步分子優化設計和制劑篩選提供了理論依據。

陸治錦;文璽凱;劉魯杰;王宜冰;沈春雷;伍 維;沈智勇;趙黎明,華東理工大學生物工程學院;上海臻格生物技術有限公司;上海市細胞代謝光遺傳學技術前沿科學研究基地,202501