引言

　　諾氟沙星 (NFX) 屬于氟喹諾酮類藥物，常用作預(yù)防和治療動(dòng)物的炎癥，如呼吸道和皮膚感染 [1]｡由于 NFX 過度使用，在環(huán)境中可檢測(cè)到大量的 NFX 殘留 [2], 環(huán)境中殘留的 NFX 又會(huì)通過生物鏈對(duì)人體構(gòu)成潛在危害，如引發(fā)腎臟疾病､過敏反應(yīng)､生殖疾病等 [3]｡因此，為了保護(hù)環(huán)境安全和人類的健康，需要開發(fā)一種高效快捷的方法實(shí)現(xiàn)對(duì) NFX 的檢測(cè)｡目前已報(bào)道了多種 NFX 的檢測(cè)方法，如熒光法 [4]､毛細(xì)管電泳 [5] 和化學(xué)發(fā)光 [6] 等｡這些方法雖然靈敏度高且準(zhǔn)確性好，但存在樣品前處理復(fù)雜､或操作復(fù)雜耗時(shí)､或需要貴重的儀器等問題｡而電化學(xué)分析方法具有靈敏度高､設(shè)備簡(jiǎn)單､易于自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)，在藥物活性成分檢測(cè)中扮演重要角色 [7]

　　碳納米纖維 (CNFs) 具備優(yōu)良的導(dǎo)電性､大的比表面積和良好的化學(xué)穩(wěn)定性，已應(yīng)用到電化學(xué)傳感器領(lǐng)域 [8]｡靜電紡絲是一種常規(guī)制備 CNFs 的方法之一｡有機(jī)聚合物通常是電紡 CNFs 的前驅(qū)體，所獲得的 CNFs 可以最大程度的暴露出活性位點(diǎn)，并且可以將電活性材料固定在表面和內(nèi)部 [9]｡同時(shí) CNFs 的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能更好的適應(yīng)電化學(xué)循環(huán)過程中變化 [10]｡殼聚糖 (CS) 是一種天然多糖，價(jià)格低廉，具有良好的粘附性和成膜性 [11], 廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)､制藥和生物技術(shù)等領(lǐng)域｡據(jù)報(bào)道，CS 可與碳基材料､金屬納米材料和離子液體等導(dǎo)電材料結(jié)合形成導(dǎo)電膜 [12], 在電極修飾方面具有較大的應(yīng)用潛力｡分子印跡聚合物 (MIP) 不僅可識(shí)別待測(cè)分子的官能團(tuán)種類 [13], 還能識(shí)別其形狀和大小 [14]｡因此，MIP 對(duì)待測(cè)分子具有高度的選擇性，引入 MIP 是提高電化學(xué)傳感器選擇性的重要策略之一 [15]｡

　　本論文以聚丙烯腈 (PAN) 為碳源，將靜電紡絲和碳化法制備的 CNFs 分散在 CS 溶液中｡利用滴涂法將其修飾在玻碳電極(GCE)上，獲得 CNFs-CS/GCE。然后以諾氟沙星(NFX)為模板分子、鄰苯二胺(o-PD)為單體，通過循環(huán)伏安法 (CV) 在 CNFs-CS/GCE 上電聚合生成 NFX 模板分子的印跡聚合物，洗脫 NFX 后得到對(duì) NFX 具有特異性識(shí)別的傳感器。使用 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻作為探針，利用差示脈沖伏安法 (DPV) 對(duì) MIP/CNFs-CS/GCE 進(jìn)行性能測(cè)定，結(jié)果顯示，該傳感器具有制備簡(jiǎn)單､靈敏､快速和選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，可成功用于牛奶中 NFX 的檢測(cè)｡

　　1 實(shí)驗(yàn)部分

　　1.1 儀器與試劑

　　FEINovaNano 型超高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 (美國 FEI 公司);Thermoescalab250Xi 型光譜儀 (上海非利加實(shí)業(yè)公司);BrukerD8 型 X - 射線衍射分析儀 (長沙艾克賽儀器設(shè)備公司);Cary660 型紅外光譜儀 (安捷倫科技公司);RST5200-0 型電化學(xué)工作站 (鄭州世瑞思儀器科技公司)｡

　　諾氟沙星 (NFX, 上海阿拉丁公司);0.01mol/L 的 NFX 標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱量 31.93mgNFX 溶于 3mL 0.1mol/L 的 HCl 中，并用超純水定容至 10mL｡聚丙烯腈 (PAN)､鄰苯二胺 (o-PD)(上海麥克林有限公司); 殼聚糖 (CS)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司); 磷酸二氫鉀 (廣東光華科技公司); 磷酸氫二鉀､亞鐵氰化鉀､甲醇和乙酸 (西隴化工試劑公司); 鐵氰化鉀､N,N - 二甲基甲酰胺 (成都科隆化學(xué)品公司); 所有試劑均為分析純，所有實(shí)驗(yàn)用水均為超純水｡

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1 CNFs 的制備

　　將 1gPAN 攪拌分散于 9gDMF 溶液中，隨后在 60℃下加熱攪拌直至 PAN 完全溶解｡將溶液超聲 40min 后在常溫下攪拌 12h, 得到均勻紡絲液｡將紡絲液裝入 10mL 注射器中，靜電紡絲參數(shù)設(shè)置為：電壓 18kV; 針尖與接收器之間為 10cm; 流速為 2mL/h; 收集器轉(zhuǎn)速為 150r/min｡紡絲結(jié)束后將收集到的 PAN 纖維在 70℃下干燥 12h｡將干燥后的 PAN 纖維放入馬弗爐中，以 5℃/min 的升溫速率升溫至 250℃, 并在 250℃下保溫 2h, 待冷卻至室溫得到預(yù)氧化纖維｡將預(yù)氧化后的纖維置于管式爐中在 N₂氣流中以一定的升溫速度從室溫升溫至 800℃，并在 800℃條件下保溫 2h，高溫碳化結(jié)束后即可得到 CNFs 材料｡

　　1.2.2 MIP/CNFs-CS/GCE 的制備

　　將 GCE 用 0.30μm 和 0.05μm Al₂O₃粉漿拋光至表面光滑，并在乙醇和超純水中進(jìn)行超聲清洗，然后用 N₂氣流吹干備用。將 CNFs 加入 CS 溶液中 (0.02g CS 溶于 1.0mL 乙酸，超純水定容至 10mL)，超聲 30min 得到均勻的 CNFs-CS 懸浮液｡使用移液槍取 5μL 滴到 GCE 電極表面，白熾燈下干燥 30min, 得到 CNFs-CS/GCE｡

　　將 CNFs-CS/GCE 放入含 NFX 和 o-PD 的磷酸鹽緩沖溶液 (pH=5.0，濃度為 0.1mol/L) 中，采用循環(huán)伏安法 (CV), 在 - 0.1~1.2V 范圍循環(huán)掃描 10 圈，掃描速率為 100mV/s, 得到 MIP/CNFs-CS/GCE｡自然晾干后，放入甲醇 - 乙酸 (體積比 9∶1) 洗脫液中浸泡 15min, 得到有 NFX 分子印跡孔穴的 MIP/CNFs-CS/GCE。聚合過程中不加入 NFX, 其他步驟相同，制備非分子印跡電極 NIP/CNFs-CS/GCE｡

　　1.2.3 電化學(xué)檢測(cè)

　　電化學(xué)行為測(cè)試在含 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻的溶液中進(jìn)行，CV 的掃描范圍為 - 0.3~0.8V, 速率為 100mV/s,EIS 交變電壓為 7mV, 頻率范圍為 1Hz~139000Hz｡測(cè)試時(shí)，先將 MIP/CNFs-CS/GCE 放入含有 NFX 的 10mL PBS (0.1mol/L) 中吸附一定時(shí)間，取出并用水沖洗后，再放入含 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻的溶液中，用 DPV 法對(duì)探針進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試，DPV 范圍為 - 0.1V~0.45V, 振幅為 0.05V｡

　　2 結(jié)果與討論

　　2.1 CNFs 材料的表征

　　對(duì) PAN 纖維､預(yù)氧化后纖維和 CNFs 的形貌分別進(jìn)行 SEM 表征。PAN 纖維缺乏取向性，呈現(xiàn)無規(guī)則排列，并且纖維相互交叉形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)｡纖維直徑范圍在 200~550nm 之間，平均直徑約為 343nm｡預(yù)氧化后纖維出現(xiàn)了彎曲收縮狀態(tài)，纖維直徑減小，平均直徑約為 325nm｡CNFs 繼承了 PAN 纖維的無序性和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其纖維直徑進(jìn)一步減小，主要是因?yàn)樵谔蓟^程中纖維的許多成分以氣體形式排出，如 H₂O、N₂和 HCN。

　　紅外光譜表征結(jié)果顯示，PAN 纖維在 1455cm⁻¹ 和 2942cm⁻¹ 處的吸收峰分別對(duì)應(yīng) - CH₂基團(tuán)的彎曲振動(dòng)和伸縮振動(dòng)，在 2244cm⁻¹ 處的吸收峰對(duì)應(yīng) - CN 基團(tuán) [16]。預(yù)氧化后纖維在 810cm⁻¹ 和 3460cm⁻¹ 處出現(xiàn)了新的吸收峰，在 810cm⁻¹ 處的吸收峰是由于預(yù)氧化過程中有芳環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，發(fā)生了環(huán)化反應(yīng);3460cm⁻¹ 處的吸收峰對(duì)應(yīng) - OH 基團(tuán)，因?yàn)轭A(yù)氧化過程中發(fā)生了脫氫和氧化反應(yīng)｡而 CNFs 的 FT-IR 光譜中無任何明顯的結(jié)構(gòu)吸收峰，因?yàn)楹谔技{米纖維具有高吸光度 [17]。

　　對(duì) PAN 纖維和 CNFs 進(jìn)行了 X 射線衍射 (XRD) 表征，PAN 纖維在 17° 和 28.8° 出現(xiàn)衍射峰，分別對(duì)應(yīng) PAN 的 (200) 和 (110) 晶面 [18,19]｡高溫碳化后，PAN 的衍射峰消失，在 24° 和 44° 出現(xiàn)衍射峰，分別對(duì)應(yīng) (002) 和 (101) 型石墨晶面，證明 CNFs 呈現(xiàn)優(yōu)異的石墨化晶體結(jié)構(gòu) [20]。

　　對(duì) CNFs 進(jìn)行 X 射線光電子能譜 (XPS) 表征，從 XPS 全譜中可以看出 CNFs 材料中出現(xiàn)了 C、N 和 O 的信號(hào)峰。C1s 的高分辨 XPS 譜被分解出 3 個(gè)典型的峰，分別對(duì)應(yīng) C-C (284.72eV)、C-N (285.74eV) 和 C=O (289.19eV) 鍵 [21,22]。N1s 的高分辨譜被擬合出 3 個(gè)單峰，分別對(duì)應(yīng)吡啶氧化 N (403.72eV)、吡咯 N (400.48eV) 和吡啶 N (398.29eV)[23]｡此外，在擬合的 O1s 光譜中，在 532.07eV 和 530.83eV 處的 2 個(gè)峰被認(rèn)為是 C-O 和 C=O 鍵 [24,25]｡

　　2.2 MIP/CNFs-CS/GCE 的電化學(xué)表征

　　采用 CV 對(duì)不同修飾電極進(jìn)行電化學(xué)表征，[Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻在 GCE 上出現(xiàn)一對(duì)氧化還原峰 (曲線 a)｡在 CNFs-CS/GCE 上，由于 CNFs-CS 具有較大的比表面積，可與探針溶液產(chǎn)生靜電作用，有助于吸附富集，因此可觀察到 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻的氧化還原峰明顯增大 (曲線 b)。在 CNFs-CS/GCE 表面聚合 MIP 膜后，MIP 膜會(huì)阻礙電子的轉(zhuǎn)移，使氧化還原峰變小 (曲線 c)｡由于 MIP 膜上的 NFX 經(jīng)洗脫后會(huì)留下印跡孔穴，為 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻提供了電子轉(zhuǎn)移通道，使氧化還原峰明顯增大 (曲線 d)｡經(jīng)重新吸附 NFX 后，膜的印跡孔數(shù)量減少，使 MIP/CNFs-CS/GCE 氧化還原峰減小 (曲線 e)｡由于 NIP 不存在印跡孔穴，因此，洗脫前后的氧化還原峰 (曲線 f、曲線 g) 無明顯變化｡結(jié)果表明，MIP 電化學(xué)傳感器對(duì) NFX 具有良好的選擇性｡

　　采用 EIS 表征不同修飾電極的阻抗變化，GCE 的阻抗很小 (曲線 a)｡CNFs-CS/GCE 比 GCE 的半圓直徑有所減小，說明阻抗變小 (曲線 b)｡MIP/CNFs-CS/GCE 阻抗變大，這是因電極表面有致密的聚合膜阻礙了探針進(jìn)入電極表面 (曲線 c)｡當(dāng)模板分子 NFX 洗脫后，印跡膜上存在 NFX 印跡孔穴，[Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻探針可通過孔穴到達(dá)電極表面，阻抗圖中半圓直徑減小，阻抗減小 (曲線 d)。由于 NIP 不存在印跡孔穴，[Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻不能有效擴(kuò)散到電極表面，所以 NIP/CNFs-CS/GCE 電極洗脫前后的阻抗圖中半圓直徑無明顯變化 (曲線 e、曲線 f)。

　　在 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻溶液中用 CV 法考察掃描速率 v 對(duì)氧化還原峰電流的影響，當(dāng) v 從 20mV/s 增大到 180mV/s 時(shí)，[Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻的氧化峰電流 (Iₚₐ) 和還原峰電流 (Iₚc) 也同步增加。Iₚₐ和 Iₚc 分別與 v 之間呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為 Iₚₐ(μA)=0.144v + 36.682(R²=0.98)和 Iₚc (μA)=-0.477v - 51.302(R²=0.99)，表明 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻在 MIP/CNFs-CS/GCE 上的電極反應(yīng)過程受吸附控制｡

　　2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

　　2.3.1 CNFs-CS、o-PD 及 NFX 濃度的優(yōu)化

　　條件優(yōu)化采用 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻的絕對(duì)峰電流進(jìn)行判斷，考察了修飾層(CNFs-CS)濃度、單體(o-PD)濃度和模板分子(NFX)濃度對(duì)電極峰電流的影響。結(jié)果顯示，峰電流隨 CNFs-CS 濃度的增大呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在濃度為 1.5mg/mL 時(shí)達(dá)到最大｡因此，選擇 CNFs-CS 的最佳滴涂濃度為 1.5mg/mL｡合適的單體和模板分子濃度有利于形成最多的分子印跡位點(diǎn)，且構(gòu)型穩(wěn)定，有利于電子的轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，峰電流隨 o-PD 濃度和 NFX 濃度的增大呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，在 o-PD 濃度為 2.0mg/mL 和 NFX 濃度為 90μmol/L 時(shí)達(dá)到最大，因此選擇 o-PD 和 NFX 的最佳濃度分別為 2.0mg/mL 和 90μmol/L｡

　　2.3.2 聚合圈數(shù)、洗脫時(shí)間和重吸附條件的優(yōu)化

　　實(shí)驗(yàn)考察了電極聚合圈數(shù)、洗脫時(shí)間和重吸附時(shí)間對(duì)峰電流的影響｡結(jié)果顯示，峰電流隨聚合圈數(shù)的增多呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，達(dá)到 10 圈時(shí)最大｡因此，選擇 MIP 最佳聚合圈數(shù)為 10｡隨著洗脫時(shí)間的增加，印跡孔穴數(shù)量增多，峰電流增大;當(dāng)洗脫 15min 后，峰電流保持平穩(wěn)，所以選擇洗脫時(shí)間為 15min｡在 0~15min 內(nèi)，隨著重吸附時(shí)間增加，峰電流減小;當(dāng)重吸附超過 15min 后，峰電流達(dá)到最小值并保持平穩(wěn)，表明 MIP 對(duì) NFX 已吸附平衡｡因此，選擇重吸附時(shí)間為 15min｡

　　2.3.3 富集電位和富集時(shí)間的優(yōu)化

　　考察了 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻探針富集電位和富集時(shí)間對(duì)峰電流的影響，結(jié)果顯示，富集電位在 - 0.1V 時(shí)峰電流達(dá)到最大值｡當(dāng)富集時(shí)間超過 60s 時(shí)，峰電流達(dá)到最大值并趨于平穩(wěn)，表明電極對(duì) [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻探針已吸附飽和，因此選擇最佳富集電位和富集時(shí)間分別為 - 0.1V 和 60s｡

　　2.3.4 pH 值對(duì)電極電化學(xué)性能的影響

　　溶液 pH 值對(duì)峰電流的影響顯著，當(dāng)溶液 pH 值從 4.0 增加至 5.0 時(shí)，峰電流逐漸增大;在 pH=5.0 時(shí)達(dá)到最大值;當(dāng)溶液 pH 值超過 5.0 時(shí)，峰電流開始逐漸減小。因此，選擇最佳的溶液 pH 為 5.0｡

　　2.4 MIP/CNFs-CS/GCE 的分析性能

　　在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，將 MIP/CNFs-CS/GCE 與NIP/CNFs-CS/GCE 置于不同濃度的 NFX 溶液中進(jìn)行吸附后，使用 DPV 法對(duì) [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻探針進(jìn)行測(cè)試。隨著 NFX 濃度的增大，峰電流逐漸減小，表明電極對(duì) NFX 的吸附量不斷增加。吸附前后的峰電流變化值 ΔI 與 NFX 濃度在 0.05~30μmol/L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，其線性方程為 ΔI=1.766c (μmol/L)+3.7236，相關(guān)系數(shù) R²=0.992。MIP/CNFs-CS/GCE 檢測(cè) NFX 的 LOD(檢測(cè)限)為 16nmol/L(S/N=3)。與 NIP/CNFs-CS/GCE 相比，MIP/CNFs-CS/GCE 檢測(cè) NFX 具有較高的靈敏度。

　　與文獻(xiàn)報(bào)道的 NFX 電化學(xué)傳感器相比，MIP/CNFs-CS/GCE 具有較寬的線性范圍和更低的檢出限，顯示出優(yōu)異的綜合性能。

　　2.5 重現(xiàn)性和選擇性

　　在相同條件下制備 7 根 MIP/CNFs-CS/GCE，對(duì)濃度為 10μmol/L NFX 的峰電流變化進(jìn)行檢測(cè)。7 支電極檢測(cè) NFX 峰電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 3.89%，表明所制備電極具有良好的重現(xiàn)性。

　　選擇與 NFX 具有相似結(jié)構(gòu)的氯霉素(CAP)、鹽酸環(huán)丙沙星(CPX)、氧氟沙星(OFLX)和四環(huán)素(TC)作干擾物。分別將 MIP/CNFs-CS/GCE 與 NIP/CNFs-CS/GCE 置于上述干擾物溶液(20μmol/L)中進(jìn)行吸附后，用 DPV 法檢測(cè)。結(jié)果顯示，MIP/CNFs-CS/GCE 對(duì) NFX 的響應(yīng)大于其他干擾物質(zhì)，而 NIP/CNFs-CS/GCE 對(duì)所有物質(zhì)的響應(yīng)均無明顯變化，說明 MIP/CNFs-CS/GCE 具有良好的選擇性。

　　2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

　　為了考察 MIP/CNFs-CS/GCE 對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)效果，對(duì)市售的牛奶進(jìn)行 NFX 檢測(cè)。將牛奶樣品進(jìn)行離心，取上清液后，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示本法檢測(cè)的牛奶中未含 NFX。

　　在牛奶中分別加入 0.5μmol/L、5μmol/L、15μmol/L 的 NFX 溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。加標(biāo)回收率在 92.03%~99.33% 之間，RSD 在 1.89%~3.66% 之間，表明 MIP/CNFs-CS/GCE 可應(yīng)用于牛奶中 NFX 的檢測(cè)。

　　3 結(jié)論

　　本文以 PAN 為碳源，通過靜電紡絲和碳化法制備出 CNFs，基于其導(dǎo)電性和 CS 的成膜性，制備了玻碳修飾電極(CNFs-CS/GCE)。以鄰苯二胺(o-PD)為功能單體、諾氟沙星(NFX)為模板分子，采用電聚合法在 CNFs-CS/GCE 上成功制備出 MIP 膜，獲得 MIP/CNFs-CS/GCE。

　　其中，經(jīng)過靜電紡絲和高溫碳化法制備的 CNFs，導(dǎo)電性好、比表面積大、穩(wěn)定性高;以電化學(xué)聚合法制備的 MIP 具有簡(jiǎn)單、快速、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。所建立的檢測(cè)方法可應(yīng)用于牛奶中 NFX 的檢測(cè)，為實(shí)際樣品中諾氟沙星的高效、準(zhǔn)確檢測(cè)提供了可靠的技術(shù)手段。

郭航雨;李利軍;馮 旭;覃丹鳳,廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院;廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心;廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)部,202406